| 研究課題/領域番号 |
26461707
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| 研究機関 | 大東文化大学 |
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研究代表者 |
後藤 孝也 大東文化大学, スポーツ健康科学部, 教授 (80284355)
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| 研究分担者 |
安田 武嗣 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 緊急被ばく医療研究センター, 主任研究員 (60332269) [辞退]
富山 健一 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 緊急被ばく医療研究センター, 博士研究員 (20584064) [辞退]
小原 千寿香 (逸見千寿香) 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 緊急被ばく医療研究センター, 研究員 (90415977) [辞退]
田嶋 克史 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 緊急被ばく医療研究センター, プログラムリーダー (80292423) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 神経線維腫 / 細胞内情報伝達 / 放射線障害 / がん遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
前年度に検討課題として残った細胞内蛋白質の分画方法の条件検討、及び放射線照射後の細胞の変化の解析を継続した。放射線（γ線）の照射前後で細胞内の蛋白質を分画した場合、細胞質内蛋白質及びクロマチン結合蛋白質の分画に発現の有意な差が２次元電気泳動上のスポットとして見られた。また、ほぼ同じ分子量のスポット数個が異なる等電点で横一列に並ぶ事が認められた。このことは、放射線照射により細胞内で変化する蛋白質のアミノ酸のいくつかに、リン酸化されるアミノ酸残基を持つことを意味する可能性が高い。
そのため、リン酸化蛋白質を選択的に結合するビーズを組み合わせて、さらに細かい分画に分けて放射線照射前後で比較検討した。この際用いた照射線量は、４Gyの比較的高い線量を用いて解析を行った。これは、これまで８Gy照射では、多くの細胞に細胞死を誘発し、１Gyでは細胞死の割合が不安定であったためである。ただし、神経細胞は本来細胞分裂がほとんど起こらないため、高線量でも細胞死に至らない場合が多い。一方、神経線維腫のモデルとなりうるRasを相対的に多く発現させた変異株では、細胞死を誘発しやすいため、照射線量に関しては、今後線量を低線量から高線量までいくつか設定して検討する必要があると考えられた。これは、良性の神経線維種の悪性転化が起こりうる線量はアポトーシスを誘発するような高線量ではなく、より低い線量ではないかと推定されるためである。
加えて、蛋白質の修飾としてリン酸化とならんで代表的な糖鎖修飾についても解析をおこなった。レクチンを用い、細胞内蛋白質分画法とレクチンビーズによる糖鎖含有蛋白質分画法とを組み合わせて、リン酸化蛋白質同様に、さらに細かく細胞内蛋白質を分画した後、同じく2D-DIGE法で検討した結果、クロマチン結合蛋白質の分画に有意差が認められた。これらの蛋白質スポットの解析は今後の課題である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
放射線による障害性を検討しているが、使用している細胞（がん遺伝子などを導入し株化した細胞）放射線感受性が一定に保てず、条件の検討に手間取っている。細胞分画を複数の条件により決定していたため、条件の最適化に時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの解析の結果、放射線照射によって変化する蛋白の二次元電気泳動のゲル上でのスポットの有力な候補の絞り込みが出来つつある。今後は、このスポットの蛋白質の同定の段階になる。これまで、蛍光色素による蛍光として解析をして来たため、可視化できていたが、実際に蛋白の解析を行うには、ある程度の量がどうしても必要になる。しかしながら、質量分析の感度は限られるため、その感度に至るまでの蛋白質の量を得るまでの条件設定は単純ではない。再現性は、これまでの解析で得られているものの、些細な条件によって蛋白質のスポットが重なったり、スポットがずれたりすることが経験されているため、これらの点をいかに克服するかが課題である。
なるべく多くの蛋白質を用いて泳動を開始する事による解決法では不純物の混入による質量解析が困難になるため、その前処理である蛋白の分画の精製度をあげるという手法で条件設定を行い、より蛋白質を濃縮できる条件検討を今後行う予定である。その後、質量分析を行い蛋白質の同定を行い、同定が終了すれば、抗体の作成などを行い解析の範囲を広げていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験の最適化のために予定以上に日時を要してしまったことによる。本来であれば、質量分析のための解析費用が使われる予定であったが、それに要する費用が予定とは異なったためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度では、質量分析の為の解析費用、また解析結果により、蛋白質の修飾の解析へのを行う計画である。
また、解析の結果得られた蛋白質の抗体（単純抗体と現在想定されているリン酸化の修飾が重要であると判断された場合は、リン酸化抗体の両者）を作成し、細胞の免疫組織解析などを解析する計画である。
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