| 研究課題/領域番号 |
26461745
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
柳田 寛太 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任研究員(常勤) (70467596)
|
|---|
| 研究分担者 |
田上 真次 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40362735)
大河内 正康 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90335357)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | γ-セクレターゼ / アミロイド / CRISPR/CAS9 |
|---|
| 研究実績の概要 |
γ-セクレターゼ非依存的なβAPPの膜内切断メカニズムを解析するため、γ-セクレターゼの主要構成タンパクであるプレセニリン1（PS1）及びプレセニリン2（PS2）を欠損させたHEK293細胞をCRISPR/CAS9法を用いて作成した。1クローンのみPS1とPS2が完全に検出されない細胞が得られ、この細胞の培養上清中のAβをELISAで測定すると、検出限界以下であった。この細胞でAβが生成しない原因はPS1とPS2をノックアウトした為なのか、オフターゲット効果なのかを調べるため野生型のPS1またはPS2遺伝子をトランスフェクションすると、どちらもAβ産生が回復した。また、家族性アルツハイマー病変異のPS1を導入するとAβ42の割合が増加し、活性のないdominant negative変異のPS1ではAβ産生は回復しなかった。以上の結果からCRISPR/CAS9法で作製したPS1/PS2ダブルノックアウト細胞はPS1とPS2を欠損しているためにγ-セクレターゼ活性を持たない事が明らかとなった。この細胞のβAPPが膜内で切断されたときに生じる3から5アミノ酸の断片ペプチドを調製しLC-Msで測定すると、数種類のペプチドが検出された。以上の事からγ-セクレターゼ活性を欠損していても膜内でβAPPが切断されていることが示唆された。現在はPS1/PS2ダブルノックアウト細胞にタンパク分解酵素の阻害剤であるTPEN（膜透過性金属キレート剤）、Bafilomycin A（リソソーム酵素阻害剤）、Lactacystin（プロテアソーム阻害剤）を加え、断片ペプチドの解析を行っている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の目的通りCRISPR/CAS9法で作製したPS1/PS2ダブルノックアウト細胞にPS1及びPS2を発現させ、Aβが生成しない原因がγ-セクレターゼ活性の欠損である事を確かめた。PS1/PS2ダブルノックアウト細胞のβAPPが膜内で切断されたときに生じる断片ペプチドはノックアウトしていない細胞に比べてかなり量が少なく測定に手間がかかったが、測定方法を工夫することにより定量することができた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
引き続きプロテアーゼやペプチダーゼ阻害剤を作用させたPS1/PS2ダブルノックアウト細胞の断片ペプチドを解析し、ペプチド産生を阻害する薬剤を探す。その結果から膜内切断に関与しているタンパクを推定し、CRISPR/CAS9で遺伝子をノックアウトする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
使用したプレセニリンの発現プラスミドやタンパク分解酵素の阻害剤は研究室にあるものを使用したので、費用がかからなかった。また、国際学会で研究成果を発表する予定であったが国内の学会での発表に替えたため、旅費が節約できた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
LC-Msの測定を担当していた技術員が退職したため、非常勤の技官を雇用する費用に充てる。残りはプロテアーゼ阻害剤や抗体等の高価な消耗品に使用する。
|
