プレセニリンγセクレターゼによるアミロイドβ切断が細胞内のどこで起こるか？

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461746
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 田上 真次 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40362735)
• 研究分担者: 大河内 正康 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90335357)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 脳神経疾患 / アルツハイマー病 / プレセニリン / γセクレターゼ / アミロイドβ / APL1β / バイオマーカー

研究実績の概要

アルツハイマー病(AD)脳に特異的に認められる老人斑の主たる構成成分は42アミノ酸からなるAβ42であり、AD病理の本体はこのAβ42の凝集過程にあるのではないかと考えられている。Aβは前駆体であるβAPPがBACEとプレセニリンγセクレターゼによる段階的蛋白分解を受けて産生される。近年我々はγセクレターゼによる最終分泌産物であると考えられていたAβ42が、実はプレセニリンγセクレターゼの基質となり、さらに凝集性が乏しいAβ38に切断されることを発見した。またAβ42のサロゲートマーカーであるAPL1β28もγセクレターゼによる切断を受けてAPL1β25に分解されることを明らかにした。本研究ではプレセニリンγセクレターゼによるγ切断やこのAβ42切断が細胞内で起こる仕組みやその局在、およびプレセニリン１に病原性突然変異体を有する家族性AD患者脳でAβ42切断が変化しているかどうかを検討している。
本年度はβAPP発現培養HEK細胞を用いて、Aβ42切断やγ切断などを可視化するため、Aβ42のC末端側に特異的に反応する断端抗体を用いて検討した。現在のところAβの前駆体であるβAPPや、βAPPがBACEにより細胞外ドメインを切断されたCTFβに対する市販抗体では特異的な染色像を得られている。
さらにプレセニリン１に各々異なる病的突然変異がある家族性AD 4例および非認知症患者の脳脊髄液中サンプル数十例中のAβ42、APL1β28などのELISAを用いた測定は完了した。解析の結果、家族性AD脳脊髄液中のAPL1β総量は対照のそれに比べて有意に低下していたが、APL1β28の値は増加も減少もしていなかった。この事実より家族性AD患者脳内ではAPL1β28からさらに短いAPL1β25などへの切断の遅延、つまりAβ42からAβ38への切断が遅延していることが示唆された。これをまとめ論文発表した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Aβ42切断やγ切断の仕組み・細胞内局在を検討する実験に関しては、複数のAβ42断端特異的抗体を用いて検討を重ねている。現在のところAβの前駆体であるβAPPや、βAPPがBACEにより細胞外ドメインを切断されたCTFβに対する市販抗体では、共焦点蛍光顕微鏡を用いて特異的な染色像を得られている。また並行してAβ42切断やγ切断の仕組みについても、酵素反応速度論的解析を行っている。従って現在のところ当該実験の進捗は順調である。
また家族性AD患者脳でAβ42切断が変化しているかどうかについては、実験を完了し家族性AD患者脳内ではAPL1β28からさらに短いAPL1β25などへの切断の遅延、つまりAβ42からAβ38への切断が遅延していることを示唆するという結論が得られたため、達成度は十分である。

今後の研究の推進方策

Aβ42切断やγ切断の仕組み・細胞内局在を検討する実験に関しては、引き続き　βAPP発現培養HEK細胞を用いてAβ42切断やγ切断などが起こっている像の可視化を試みる。またER,Golgi,early endosome, late endosome, lysosomeなどの標識蛋白に対する抗体と多重染色し、共焦点顕微鏡のcolocalizationソフトウエアを用いて局在部位を詳細に検討する。さらに培養細胞にGSIやGSMなど抗AD根本治療薬の候補となっている薬剤をかけ、Aβ42切断やγ切断などが薬剤で処理しない場合と比較して変化しているかどうかを調べる。
Aβ42切断が家族性AD脳内でどのように変化しているのかを調べる実験に関しては、
家族性AD、孤発性AD患者および非認知症患者の脳脊髄液中サンプル中の測定可能なすべての分子種（Aβ42,43,40,38,37など）をELISA法で測定する。さらなる新たな知見を得るため、それらの解析を進める。

次年度使用額が生じた理由

研究は計画通りに順調に進展しているが、個々の実験および統計学的解析については変更があった。

次年度使用額の使用計画

今年度未達の研究予定を含め、予定通りに次年度の研究を進めるなかで研究費を執行していく。

研究成果

• [雑誌論文] Fluvoxamine alleviates ER stress via induction of Sigma-1 receptor. (2014)
  • 著者名/発表者名: Omi T, Tanimukai H, Kanayama D, Sakagami Y, Tagami S, Okochi M, Morihara T, Sato M, Yanagida K, Kitasyoji A, Hara H, Imaizumi K, Maurice T, Chevallier N, Marchal S, Takeda M, Kudo T.
  • 雑誌名: Cell Death Dis. 巻: 5 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1038/cddis.2014.301.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Transcriptome analysis of distinct mouse strains reveals kinesin light chain-1 splicing as an amyloid-β accumulation modifier. (2014)
  • 著者名/発表者名: Morihara T, Hayashi N, Yokokoji M, Akatsu H, Silverman MA, Kimura N, Sato M, Saito Y, Suzuki T, Yanagida K, Kodama TS, Tanaka T, Okochi M, Tagami S, Kazui H, Kudo T, Hashimoto R, Itoh N, Nishitomi K, Yamaguchi-Kabata Y, Tsunoda T, Takamura H, Katayama T, Kimura R, Kamino K, Hashizume Y, Takeda M.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 111 ページ: 2638-2643
  • DOI: 10.1073/pnas.1307345111.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Relative ratio and level of amyloid-β 42 surrogate in cerebrospinal fluid of familial Alzheimer disease patients with presenilin 1 mutations. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tagami S, Okochi M, Yanagida K, Kodama T, Arai T, Kuwano R, Ikeuchi T, Takeda M.
  • 雑誌名: Neurodegener Dis. 巻: 13 ページ: 166-170
  • DOI: 10.1159/000355258.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 末梢血中のAβ42サロゲートマーカー、APL1b28の開発状況について (2014)
  • 著者名/発表者名: 田上 真次 大河内 正康 佐野 聖三 柳田 寛太 児玉 高志 水田 直樹 朝長 毅 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] γセクレターゼの阻害と促進 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大河内 正康 田上 真次 柳田 寛太 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] iPS由来ヒト大脳皮質神経細胞のAβ産生に関連する性質 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大河内 正康 柳田 寛太 大山 洋 児玉 高志 高見 真子 井原 康夫阪口 岳 田上 真次 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] γ-secretase modulatorはAD由来のiPS細胞にも効果がある (2014)
  • 著者名/発表者名: 柳田 寛太 大山 洋 大河内 正康 田上 真次 児玉 高志 水田 直樹 阪口 岳 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] 細胞内に存在するAβ由来のオリゴペプチドのLC-MS/MSによる測定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 児玉 高志 大河内 正康 田上 真次 柳田 寛太 水田 直樹 高見 真子 井原 康夫 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] 脳脊髄液中のAβ分解産物の同定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 水田 直樹 大河内 正康 田上 真次 柳田 寛太 児玉 高志 佐野 聖三 朝長 毅 森原 剛史 田中 稔久 武田 雅俊
  • 学会等名: 第33回 日本認知症学会 学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 会議センター
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-12-01
• [学会発表] Levels of an amyloid beta42 surrogate marker in CSF of familial Alzheimer disease patients (2014)
  • 著者名/発表者名: Shinji Tagami, Masayasu Okochi, Kanta Yanagida, Takashi Kodama, Takeshi Ikeuchi Takashi Morihara, Tetsuaki Arai, Toshihisa Tanaka, Masatoshi Takeda
  • 学会等名: XVI World Congress of Psychiatr
  • 発表場所: Madrid, Spain
  • 年月日: 2014-09-14 – 2014-09-18
• [備考] 研究者詳細 - 田上 真次 - 研究者総覧 - Osaka University
  • URL: http://www.dma.jim.osaka-u.ac.jp/view?l=ja&u=6275
• [備考] 大阪大学大学院医学系研究科 精神医学教室
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/psy/www/jp/index.html