| 研究課題/領域番号 |
26461882
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
小川 良平 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (60334736)
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| 研究分担者 |
鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 講師 (30524243)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | エクソソーム / HEK293細胞 / miRNA / shRNA |
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| 研究実績の概要 |
HEK293細胞をエクソソーム（Ex）を大量に産生する細胞に改変するために、中性スフィンゴミエリナーゼ-2遺伝子とTSAP-6遺伝子のクローニングを終了し、それぞれの遺伝子について配列分析による確認を行った。これらの遺伝子をCMVプロモーター下流に結合して構築した発現ベクターをHEK293細胞に一時的に導入して、過剰発現することをリアルタイムPCR法で確認した。現在、タンパクレベルでの過剰発現の確認のためにイムノブロッティングを試みている。また、マイクロRNA上の塩基シグナルを認識してこれをEx中に送達するタンパクであるhnRNPA2B1の遺伝子をクローニングした。この遺伝子については、現在塩基配列分析の準備をしている。これらの遺伝子は最終的には安定的にHEK293細胞に導入して、Exの大量発現利用するものであるが、同時に導入するためのハイグロマイシンとピューロマイシンの２種類の異なる耐性遺伝子を持つレトロウイルスベクターの構築も終了した。
モデルとしてExに送達するRNAとしては、まず、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害するmiRNA様のshRNAを予定している。これに関しては、すでに設計済みで、hnRNPA2B1により効率良くExに送達されるように、認識配列を導入してある。また、モデル実験の標的細胞としてルシフェラーゼを恒常的に発現する２種類の細胞を構築した
実際にExに導入するmiRNAおよびsiRNAについては、発現を抑制することで放射線感受性が増強するとされるUHRF1遺伝子に対するものを検討している。２種類のmiRNA様shRNAの配列を設計して発現ベクターを構築した。これらをHEK293細胞に導入したところ、UHRF2遺伝子の発現の抑制が観察されたが、最大で70%程度であった。現在、この抑制により放射線感受性にどの程度の変化があるのかについての検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度の遅れを引きずっており、まだやや遅れているのが現状である。クローニングに関しては順調に進みだしているので、徐々にペースを上げていきたい。そのために、Exの精製、検出などについては予備実験として一通り行っているので、Ex大量産生細胞が構築でき次第、計画した実験の実証までは少なくとも終わらせる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の方針と同様であるが、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするモデル系での実証を急ぎたい。Ex高産生細胞が構築できれば、すぐに実証試験に取りかかれるように準備はできている。そのため、改変細胞のEx高生産の確認や目的RNAのExへの送達の効率化などについての分析方法の確立も急ぎたい。モデル系での実証試験については、今年度の前半にも結果を得られると考えている。最終目標である、実際の標的遺伝子に対するRNAの細胞への送達による放射線感受性の増感についてもモデル系での実験と並行して進めていき、早い段階で結果を得られるようにしたい。可能であれば、異なる標的遺伝子のsiRNAなどを採用し、複数の遺伝子の制御による治療効果の向上についても検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一昨年度の遅れによる繰り越しが消化しきれなかったため。昨年度とほぼ同程度の繰り越しになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Exの精製や検出に注力する予定であるため、それらのためのキットなどの消耗品に当てる予定である。
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