| 研究課題/領域番号 |
26461919
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
蒲原 英伸 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 准教授 (90398222)
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| 研究分担者 |
木下 順弘 熊本大学, その他の研究科, 教授 (30195341) [辞退]
鷺島 克之 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40336235)
田代 貴大 熊本大学, 医学部附属病院, その他 (00613340)
新森 大佑 熊本大学, 医学部附属病院, その他 (70635789)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | SIRS / CXCL8 / CXCR1 / CXCR2 / 好中球 / 細胞内輸送 / 細胞遊走 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内における炎症反応はNFkappaBを主体としたシグナル伝達により惹起される。健常者の好中球を分離しCXCXL8の刺激により遊走活性が亢進することが確認されたが、この反応はNFkappaBの阻害作用を有するCurcuminにより抑制された。好中球の遊走反応は細胞内のCaイオンの推移に比例するが、Curcuminの刺激により濃度依存性に細胞内のCaイオンの増加が認められた。Curcuminの様相活性のメカニズムを解析するために、CXCL8の受容体のCXCR1とCXCR2の好中球表面における発現の変化をFACSにて解析を行った。これまでの結果でCXCL8の刺激によりCXCR1とCXCR2は細胞内にinternalizationされ、細胞表面のCXCR1とCXCR2の数は減少し、活性好中球を洗浄しFreeのCXCL8を除くと、CXCR1とCXCR2は新たに細胞表面に数が回復する。この反応はCurcuminにより抑制され、Curcuminの濃度依存性にCXCR1とCXCR2は細胞表面への回復が減少する。つまり受容体とリガンドが結合した状態でinternalizationされ、細胞内シグナル伝達が展開される。その後この受容体はCXCL8と離解し、受容体のみ細胞表面に回復していく (受容体のRecycling)。Curcuminは好中球における受容体のRecyclingを抑制している可能性が示唆された。これらの反応は蛋白合成阻害剤の存在下にて確認され、新たな受容体の発現によらない受容体のrecycling systemが存在することが改めて確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CXCL8による好中球の遊走活性にはリガンドCXCL8と受容体CXCR1とCXCR2の結合体が細胞内へinternalizationされることにより開始され、その後のfreeの受容体がRecyclingにより細胞表面に発現し、さらなる好中球の遊走活性が継続・増強される。このRecycling systemを明らかにするために、蛋白の細胞内における輸送に関わる分子との相互関係に着眼していく。G-protein coupled receptor(GPCR)の研究において、細胞内におけるinternalization, recyclingなどorganelle間の輸送に関わる分子として、Rab familiyが指摘されている。CurcuminやCXCL8の存在下で、CXCR1もしくはCXCR2とRabとの結合状態をIP-Westernなどにより明らかにすることにより、好中球遊走活性に関連するRab familyとの関連性を明らかにししていく。さらにSIRS病態における好中球を用いて、CXCR1とCXCR2の発現を測定し、Crucuminによる制御の可能性を検証する。またの受容体に特異的細胞内輸送分子のRabを標的とした新たなSIRS制御薬としての可能性を追求する。
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| 今後の研究の推進方策 |
好中球がCXCL8により刺激を受け、CXCR1もしくはCXCR2と結合し、細胞内にinternalizationされ、細胞内のorganelle間を移動する。最終的にはRecyclingの機序により細胞表面に戻ることが予想されるが、このメカニズムを解析し新たなSIRSへの応用治療を開発していくために以下の予算が必要となってくる。
血液から白血球を分離抽出するための試薬購入。CXCR1およびCXCR2受容体の蛋白・mRNAの解析のためのかかる試薬・キットの購入。細胞培養にかかり消耗品の購入。細胞刺激のためのサイカインとその測定のための試薬・キット購入。細胞内輸送に関わる分子に関する抗体の購入と解析キットの購入。臨床データベースの整理と統計解析のためのコンピューターとソフト購入。研究成果の学会発表および情報収集のたまの学会参加にかかる費用。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CXCL8による好中球の遊走活性には受容体のCXCR1とCXCR2の結合とその細胞内取り込みが関与している。今後そのメカニズムを明らかにするためには、CXCR1とCXCR2の細胞内輸送がいかに行われているかを示す必要性がある。その為には、引き続き、健常者からの好中球の分離し解析につなげていくことと。メカニズムを明らかにするための測定系(IP-Western blotting)として、新たな抗体を用いての解析が必要である。また今後、患者同意が得られたSIRSに関連した臨床検体から好中球を分離し、SIRSを標的とした解析も必要となる。標的分子が明確化された場合には、抗体や阻害剤などを用いての解析となることが予想される。
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| 次年度使用額の使用計画 |
好中球がCXCL8により刺激を受け、CXCR1もしくはCXCR2と結合し、細胞内にinternalizationされ、細胞内のorganelle間を移動する。最終的にはRecyclingの機序により細胞表面に戻ることが予想されるが、このメカニズムを解析し新たなSIRSへの応用治療を開発していくために以下の予算が必要となってくる。
血液から白血球を分離抽出するための試薬購入。CXCR1およびCXCR2受容体の蛋白・mRNAの解析のためのかかる試薬・キットの購入。細胞培養にかかり消耗品の購入。細胞刺激のためのサイカインとその測定のための試薬・キット購入。細胞内輸送に関わる分子に関する抗体の購入と解析キットの購入。臨床データベースの整理と統計解析のためのコンピューターとソフト購入。研究成果の学会発表および情報収集のたまの学会参加にかかる費用。
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