| 研究課題/領域番号 |
26461932
|
|---|
| 研究機関 | 大阪医科大学 |
|---|
研究代表者 |
廣川 文鋭 大阪医科大学, 医学部, 講師 (20322373)
|
|---|
| 研究分担者 |
内山 和久 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80232867)
高井 真司 大阪医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80288703)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 急性肝不全 / 肥満細胞 / セリンプロテアーゼ / キマーゼ / マウス / 炎症細胞 / RT-PCR / 免疫染色 |
|---|
| 研究実績の概要 |
急性肝不全における肥満細胞セリンプロテアーゼ（キマーゼ）における役割を解明するため、マウスにリポポリサッカライド（LPS）の4μg/kgとD-ガラクトサミン（Galn）の600 mg/kgを腹腔内に投与することで急性肝不全モデルを作製し、LPS+D-Galn投与後の血液および肝臓組織を解析した。また、生存率についても評価した。
LPS+D-Galn投与後１時間の時点で、血液中の炎症誘発物質であるTumor necrosis factor (TNF)-αが著明に増加し、LPS+D-Galn投与後7時間の時点では血液中のASTとALTが共に有意に増加した。肝臓組織切片の解析より、LPS+D-Galn投与後3時間の時点より好中球などの炎症細胞浸潤が明らかに増加し、LPS+D-Galn投与後7時間の時点では明らかな肝細胞の壊死がびまん性に見られた。LPS+D-Galn投与後8時間より死亡する例があり、LPS+D-Galn投与後24時間の時点では生存率が15％（20匹中3匹が生存）になった。この24時間の時点で生存したマウスは、その後死亡することなく回復した。
血液中の肥満細胞セリンプロテアーゼであるキマーゼの活性は確認できなかったが、肝臓組織抽出液中のキマーゼ活性は、LPS+D-Galn投与後１時間の時点から有意に増加し、7時間まで高値を示した。そして、肝臓組織中のTNF-αおよびキマーゼの遺伝子発現もLPS+D-Galn投与後１時間の時点から有意に増加していた。一方、ミエロペルオキシダーゼの遺伝子発現は、LPS+D-Galn投与後１時間では低値で3時間より有意に増加し、７時間で更に増加した。
これらの結果より、LPSの4μg/kgとD-Galnの600 mg/lgを腹腔内投与することにより、急性肝不全が形成されることが確認できた。また、急性肝不全の病態解析に必要な血液よび肝臓組織中の各パラメーターの測定方法も確立できた。そして、急性化不全モデルにおいて肥満細胞セリンプロテアーゼであるキマーゼが肝臓組織中で著明に増加してくることが確認できた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究開始1年目であったので、急性肝炎のモデルを作製の確立と解析方法の確立を目標とした。急性肝不全モデルの作製には一般的にLPS+D-Galnを使用して作製する方法が多くの論文で報告されてきたため本研究にもLPS+D-Galnにて作製することにしたがLPSおよびD-Galnの投与濃度は論文により大きく異なっていたため、各試薬の指摘濃度を選定することを最初に行った。具体的にはLPSを1,2,4および10μgとD-Galnを400,600および800mgをそれぞれ組み合わせて死亡するまでの時間と投与後生存率を評価した。LPSの10μgでは投与後6時間より死亡例が出始め12時間時点でD-Galnのすべての濃度で全例死亡した。LPSの1 μgではD-Galnのすべての濃度で死亡例が見られなかった。最終的にLPSの4μg/kgとD-Galnの600mg/kgを投与することで、8時間まで死亡例がなく24時間で死亡率が85％（生存率が15％）にあるモデルができた。血液中の炎症マーカーのTNF-αは市販マウスTNF-α測定用のELISAキットにて測定できることを確認し、そしてLPS+D-Galn投与後1時間の時点でTNF-αが著明に増加していた。ASTとALTはSRLにて測定依頼しLPS+D-Galn投与後7時間時点で有意に増加することを確認した。肝臓組織切片を用いて好中球の発現指標として用いられるﾐｴﾛﾍﾟﾙｵｷｼﾀﾞｰｾﾞを免疫染色することにより炎症細胞の集積を確認できLPS+D-Galn投与後3時間の時点より好中球などの炎症細胞が浸潤することが判明した。また肝臓組織抽出液を用いてキマーゼ活性の測定方法も確立できLPS+D-Galn投与後1時間の時点から有意に増加していることを確認できた。肝臓組織抽出液ではTNF-αおよびキマーゼの遺伝子発現の定量方法も確立できこれらの遺伝子発現解析の結果LPS+D-Galn投与後1時間の時点から有意に増加していることが確認できた。急性肝不全モデルの確立と解析方法が確立できたことより概ね今年度の目標は達成できたと考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、今年度に確立された急性肝不全モデルを用いてキマーゼ阻害薬とプラセボ投与と各病態パラメーターおよび生存率を比較することにより急性肝不全におけるキマーゼの役割を明確にする予定である。具体的にはLPS（4μg/kg）+D-Galn（600mg）を投与する前よりキマーゼ阻害薬である非ペプチド性キマーゼ阻害薬であるTY-51469またはペプチド性阻害薬であるSuc-Val-Pro-p(OPh)2の1 mg/kg、10 m/kg、100 m/kgを投与し、これらのキマーゼ阻害薬投与による影響を解析する。また投与後24時間までの生存率も比較する。解析項目は血液中の解析項目として、LPS+D-Galn投与後1、3、7時間の時点で採血し、ASTとALTをSRLにて測定依頼しTNF-αは市販のELISAキットにて測定する。肝臓組織の解析もLPS+D-Galn投与後1,3,7時間の時点で肝臓を摘出し、組織切片標本用に１部をカルノア固定化、そして残存組織は液体窒素で急速冷凍して酵素活性測定用と遺伝子発現測定用に使用する。肝臓組織切片では、肝臓の障害程度をグレード化するためHE染色を行う。また好中球浸潤の指標として抗マウスミエロペルオキシダーゼ抗体を用いて免疫染色したのち単位面積あたりのミエロペルオキシダーゼ陽性細胞（好中球）数を測定する。組織抽出液を用いてキマーゼの基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCAを用いて活性測定を行い、タンパク濃度で補正を行う。また組織中のTNF-αおよびキマーゼの遺伝子発現は、肝臓組織中のRNAをトリゾール試薬にて抽出し、その後cDNAを作製してRT-PCRを行う。尚ハウスキーピング遺伝子としては、一般的にはGAPDHが汎用されているが、急性肝不全のモデルではGAPDHでは不適切なので18s rRNAを用いて補正を行う。これらの解析結果よりLPS+D-Galn投与による急性肝不全に対するキマーゼ阻害薬の前投与による影響を継時的に解析し急性肝不全発症におけるキマーゼの病態生理学的役割を解明することを目標とする。
|
