| 研究課題/領域番号 |
26462013
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
竹政 伊知朗 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50379252)
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| 研究分担者 |
水島 恒和 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00527707)
山本 浩文 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30322184)
佐藤 太郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40368303)
畑 泰司 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70644912)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 大腸がん / 非侵襲性KRAS変異検査 / 次世代シーケンサー / 感受性性診断 |
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| 研究実績の概要 |
進行大腸癌に対する抗EGFR療法のbenefitは野生型KRASの患者に限られているため、生検サンプルなどあらかじめ癌組織の遺伝子検査を行い、適用のある患者を選別する必要がある。KRAS変異は抗EGFR治療中にも獲得されることが認識され、獲得耐性の重要なメカニズムの一つとして提唱されるようになった。血液中から低頻度の変異クローンを検出できれば、原発巣が野生型の患者が治療経過中変異を来した場合、無益な治療の継続を回避することが可能となり、診断精度の改善および費用対効果の改善につながることが期待される。本研究では、従来の検査の感度を向上させることで血液検体を用いた非侵襲性KRAS変異検査を確立し、病勢モニタリングや耐性変異を標的とする新しい分子標的薬の適用決定など新しい用途の研究開発を行うことを目的とする。
本年度は大阪大学と基幹関連施設での高度進行大腸癌の標本（原発巣、生検サンプル、全血）を集積・保管するシステムを構築した。
次世代シーケンサーを用いた血漿中大腸癌由来変異DNA検出法の確立するため、実験系のバックグラウンドノイズを測定し、コマーシャルのゲノムDNAサンプルを用いて解析により条件設定を完了した。実際の臨床サンプル（原発巣、生検サンプル、血液）を対象としてKRAS変異の相同性について検証した。サンプルにより、組織、術前血漿でのmutationの割合が高く、術後の血漿においては、mutationが少なくなっていることが確認された。これらの結果は、薬剤感受性、病態などを予測するのに重要な情報を与えると考えられる。
以上のように、血液中のcfDNA（セルフリーDNA）の解析により、大腸癌組織の変異を検出できる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでに大阪大学およびその基幹関連施設からなる臨床試験推進組織である大阪大学大腸疾患分科会をベースに、対象となる高度進行大腸癌症例の標本（原発巣、生検サンプル、全血）臨床病理所見データの回収・保管システムを構築した。また次世代シーケンサーを用いてPCR増幅したKRAS断片を10万回以上配列決定することにより、エラー率の低い血漿中大腸癌由来変異DNA検出法を確立した。さらに同一鋳型を逆方向から配列決定するオプション技術や、個々の塩基のエラー率を正確に調べることで配列読み取り精度を向上させることに成功した。
平成27年度の実施計画項目として、遠隔転移を有する10例のサンプルを対象として、生検サンプルと血液サンプルの解析で同じKRAS変異が検証できた。ただし、薬剤耐性、感受性データが揃った症例での、組織サンプルと血漿サンプルのタイムコースを取得することに時間を要し、当初の予定症例の解析からやや遅れている。
また、採取する場所の違いにより、異なる結果が出る場合があるため、血液中サンプルを用いた場合の感度の安定性を検証すると共に、生体サンプルを複数調べることにより、双方の結果の安定性の違いの検証も今後の課題である。
現在、検出感度のスレッシュフォールド変化による一致率検討、単純相関検討、他技術による感度比較、薬剤応答情報を基にした生検サンプル、血液サンプルの感度、特異度の検討をすすめている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 生検サンプでのKRAS変異と血液サンプルでのKRAS変異の相同性についての検証
さらに症例数を増やして、生検と血液サンプル中とのKRAS変異結果の検証を続け、薬剤応答との比較により、その感度と特異度を調べる。
組織サンプルも合わせて解析し、heterogeneityの検討と、その後の血漿サンプルのタイムコースが取得し、耐性変異の検出を目指す。そのために遠隔転移を有し、薬剤投与によって腫瘍は縮小したケース、一旦腫瘍縮小効果が得られたもののfailureして、腫瘍増大に転じたケースのサンプルを継続して収集する。また前回、ctDNAの収量が良くなかったサンプルについては、組織からのDNAを活用して、KRASとCancer Panel（他の遺伝子）で変異を調べるとともに、血漿サンプルについてPCRで増幅が可能であるかどうかを検討する。
2) 50症例以上のサンプルについて、前向き試験を行う。
これまでの後向きサンプルの結果と同じ感度、特異度が再現しない可能性がある。その場合、スレッシュフォールドの見直し、臨床情報による層別解析をおこない、感度、特異度を高める検討を行う。KRAS野生型患者を対象に、抗EGFR抗体導入前後、増悪後の各ポイントで血液を測定し、化学療法中の簡便なKRAS測定による極めの細かい個別化化学療法の実践の可能性を検討する。
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