2014 年度実施状況報告書

肝内胆管癌におけるHemidesmosome関連蛋白の働きと治療への応用

研究課題

研究課題/領域番号	26462051
研究機関	兵庫医科大学
研究代表者	宇山直樹兵庫医科大学, 医学部, 講師 (70402873)
研究分担者	飯室勇二兵庫医科大学, 医学部, 教授 (30252018) 鈴村和大兵庫医科大学, 医学部, 講師 (50434949) 藤元治朗兵庫医科大学, 医学部, 教授 (90199373) 平野公通兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (90340968)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2018-03-31
キーワード	hemidesmosome / 肝内胆管癌 / 癌細胞 / 線維芽細胞
研究実績の概要	肝内胆管癌組織におけるHemidesmosome構成蛋白の免疫染色を行った。Plectin Integrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151 細胞外マトリックスとしてのlaminin Collagen Type IV の発現を認めた。癌細胞に関してはPlectin Integrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151すべて認め、CAF に関してはPlectin Integrin beta1 CD151を認めた。肝内胆管癌細胞株および分離線維芽細胞 LX-2 細胞における上記蛋白発現は現在進行中である。また、実験を行っていく上でのCAF のcharacterizationが必要であることから、alpha-SMA, Fascin, Fibulin-2, Thy-1, PDGFR-alpha, PDGFR-betaの免疫染色を行った。CAF は alpha-SMA+, Fascin-~+, Fibulin-2+, Thy-1+, PDGFR-alpha+, PDGFR-beta+であった。肝内線維芽細胞として類洞内星細胞(HSCs)、門脈域線維芽細胞(PFs) があるが、HSCsはalpha-SMA+, Fascin+, Fibulin-2-, Thy-1-, PDGFR-alpha-, PDGFR-beta+、PFsはalpha-SMA+, Fascin-, Fibulin-2+, Thy-1+, PDGFR-alpha+, PDGFR-beta+であった。以上より肝内胆管癌内CAFsはPFs>>HSCsに似ていることがわかった。今後、Vitro の実験でマーカーとして用いる予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由今後、癌細胞とCAF の共培養実験を予定している。癌組織から線維芽細胞がisolateできないときには、よく似た線維芽細胞のセルラインが必要になるため、CAFのcharacterization が必要になった。そのため予定していた実験が遅れた。
今後の研究の推進方策	現在、肝内胆管癌細胞株および線維芽細胞におけるmRNA レベルでのIntegrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151 の発現は確認しているが、蛋白レベルでの発現（western Blot）は現在進行中である。今後、Integrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151 に対するSiRNAを用いてhemidesmosome 関連蛋白の発現を抑制し、胆管癌細胞及びCAFsにおける増殖能　浸潤能　およびコラーゲン産生能について検討する。また、Integrins に対しては中和抗体も用いて上記機能解析を行う。
次年度使用額が生じた理由	当初計画していた、癌細胞に対する遺伝子発現抑制実験で使用する、Integrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151 に対するSiRNAs, 細胞培養液、増殖assay kit, コラーゲンAssay　kit, Invasion Assay Kit　を購入しなかったため。
次年度使用額の使用計画	癌細胞に対する遺伝子発現抑制実験で使用するIntegrinalpha6 beta4 beta1 Bp180 CD151 に対するSiRNAsを購入する予定。また増殖能、コラーゲン産生能、浸潤能測定に使用する増殖assay kit, コラーゲンAssay　kit, Invasion Assay Kit　を購入する予定である。