| 研究課題/領域番号 |
26462162
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
久門 良明 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座教授 (80127894)
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| 研究分担者 |
渡邉 英昭 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30322275)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / マクロファージ / NG2 / CD200 |
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| 研究実績の概要 |
脳梗塞巣に侵入するマクロファージ（MP）にはNG2 proteoglycan(NG2)とCD200を発現する細胞群がある。CD200はCD200R（受容体）を発現するマイクログリアやMPの起炎症反応を抑制する分子として知られており、虚血脳における両者の役割をラット中大脳動脈一過性閉塞モデルを用いて明らかにした。
その結果、梗塞巣MPはNG2陽性細胞とCD200陽性細胞に分類でき、NG2陽性細胞はCD200陰性、CD200陽性細胞はNG2陰性であった。Iba1陽性細胞（＝MP）は、ほぼ全てCD200Rを発現した。CD200は、exon1、2およびexon3の一部に由来する配列が欠損したCD200-truncated form(CD200S)を発現し、梗塞中心部ではCD200SがCD200-full-length(CD200L)に比べmRNAの発現が有意に高かった。CD200の蛋白発現は、OX2抗体では梗塞対側や辺縁に、抗CD200 C末抗体では梗塞中心部に高発現した。抗CD200 C末抗体はCD200S特異的抗体で、OX2抗体はCD200L特異的抗体と考えられた。多くのCD200陽性細胞はCD200LとCD200Sを共発現していた。さらに、NG2陽性細胞は梗塞巣皮質に、CD200陽性細胞は梗塞巣脳梁に集簇しており、NG2陽性細胞周辺にはOX2抗体のみ陽性のCD200L陽性変性組織が多く存在していた。CD200陽性細胞はCCL2、iNOS、IL-1β、TLR4、CD68、CD163、TGFβに陽性で、NG2陽性細胞はCD86を除いて陰性であった。
これらの結果より、梗塞巣MPにはNG2陽性細胞とCD200陽性細胞の2種類があり、梗塞中心部のCD200陽性細胞は起炎症性活性を有し、NG2陽性細胞は起炎症性メディエーターや貪食能が抑制されていると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の目標は、脳梗塞巣におけるCD200、CD200Rの遺伝子発現ならびに蛋白発現を経時的に観察し、またその局在を免疫組織化学的に経時的に検討し、特に浸潤細胞での両者の発現変化を明らかにすることであった。その目的を達成するために、（1） ラットに中大脳動脈領域の脳梗塞を作製し、梗塞巣におけるCD200とCD200RのmRNA発現量をリアルタイムPCRで、蛋白発現量をウェスタンブロットで経時的に評価すること、（2）同様に梗塞巣におけるCD200とCD200Rの局在について両者への抗体を用いて免疫組織学的に検討し、発現細胞の経時的変化を観察すること、（3） ラットへの虚血負荷後2、5、7、14日目に脳を摘出し、虚血巣より単離したマクロファージを免疫蛍光染色し、CD200、CD200Rの発現をIba1, NG2ともに観察し、発現の変化を検討することを計画した。
今年度に予定した研究は、概ね計画通りに行なわれ、CD200,CD200Rの遺伝子ならびに蛋白発現の経時的変化と局在が明らかになった。また、CD200およびCD200Rの機能も把握できた。
つまり、梗塞巣に集積するマクロファージには、NG2陽性細胞とCD200陽性細胞の2種類があり、梗塞中心部のCD200陽性細胞は起炎症性活性を有し、NG2陽性細胞は起炎症性メディエーターや貪食能が抑制されていると考えられた。NG2陽性細胞の周囲には神経細胞由来と考えられるCD200L陽性変性組織が存在し、CD200L陽性組織と自身のCD200Rとの相互作用による起炎症反応の抑制効果が示唆された。CD200陽性細胞はCD200LとCD200Sを共発現しており、CD200L-CD200Rによる起炎症性活性の抑制がCD200Sによって無効化されていると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度の研究結果から、CD200およびCD200Rの虚血脳における役割がある程度明らかになった。今後は、様々な環境下で両者の発現を変化させて、それぞれの役割や相互関係を更に追求するとともに、浸潤細胞を用いた虚血脳の新しい治療法の開発に結びつけて行く。
そこで平成27年度は、脳梗塞巣中心部から分離培養したマクロファージ様細胞にリポポリサッカライドを添加して活性化させた条件で、CD200、CD200Rの発現変動、ならびに起炎症性メディエータや神経栄養因子の発現を測定し、そのような環境下での役割の変化を明らかにしていく。また、CD200を強制発現させたC6細胞株を作成してマクロファージ様細胞との混合培養を行い、CD200の高発現環境下での起炎症性メディエータや神経栄養因子発現への影響を明らかにしていく予定である。
また平成28年度には、CD200を強制発現させたC6細胞株とマクロファージ様細胞との混合培養に、抗CD200R抗体を添加してCD200-CD200R相互作用を阻害する環境をつくり、起炎症性メディエータや神経栄養因子発現への影響を明らかにする。さらに、虚血ラットに抗CD200R抗体を注入することによる脳梗塞治療効果を明らかにしていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
既に購入していた薬品や動物を使用したこと、成果発表の機会を今年度は控えたことにより、予定よりも出費が抑えられたためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度は、新たに薬品、実験機材や動物を購入すること、成果発表の機会を今年度は控えないことにより、計画通りの使用となる見込みである。
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