| 研究課題/領域番号 |
26462184
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
上羽 哲也 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 教授 (00314203)
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| 研究分担者 |
八幡 俊男 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 助教 (40380323)
東 洋一郎 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (80380062)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 膠芽腫 / エピジェネティクス / メチル化DNA結合タンパク |
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| 研究実績の概要 |
細胞の増殖や分化におけるメチル化DNA結合タンパクMBD1の機能を明らかにするために、精巣、神経細胞、星状細胞、悪性グリオーマ細胞とその幹細胞におけるMBD1アイソフォーム(CXXC-3、ΔCXXC-3)の発現を定量化し、細胞特異的な発現制御を見出していた。これらのアイソフォームはCXXC-3ドメインをコードするエキソン12の有無を決定する選択的スプライシングにより生じる。このアイソフォームの発現量をレポートするシステムの構築や発現量に依存した各種細胞の濃縮に応用するためにCXXC-3ドメインをコードするエキソン12の周辺領域を含むmini gene construct を作成した。エキソン12が含まれないスプライシング様式 (ΔCXXC-3) を示す場合にレポーター遺伝子が発現するベクターを各種細胞に遺伝子導入し、レポーターとして用いたルシフェラーゼ活性とqRT-PCRにより定量化したΔCXXC-3の発現量を検討すると正の相関性が得られた。このベクターをさらに改変することで細胞ソーティングや薬剤耐性による選択培養により、スプライシングフォームの異なる細胞を濃縮後、細胞の性状解析が可能である。また、エキソン12がコードするアミノ酸配列に対する抗体を作成し、ウエスタンブロッティングや免疫細胞化学染色により、CXXC-3のアイソフォームを特異的に認識することを確認できた。この抗体を用いることでMBD1の２つのアイソフォームCXXC-3とΔCXXC-3の悪性脳腫瘍組織や細胞における分布や局在を検討することが可能になった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MBD1のスプライシングフォームをレポートするベクターを完成させ、さらに、それを確認するために有用な抗体も作成できている。また、この抗体を膠芽腫組織における発現検索に用いることでMBD1のアイソフォームの腫瘍生物学的な機能を評価することが可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
MBD1アイソフォームのレポーターベクターを導入した細胞をフローサイトメトリーにより細胞分化レベルや細胞周期を解析することで膠芽腫の細胞分化とMBD1の機能の関連性を明らかにする。siRNAを用いたノックダウンにより膠芽腫細胞におけるアイソフォームΔCXXC-3の癌形質における機能を検討する。CXXC-3特異的な抗体により悪性脳腫瘍の悪性度との相関性を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の中の極一部であるが、大きな経費がかかる解析が完了していない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
予定通りに研究を遂行するために消耗品に使用する予定である。
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