| 研究課題/領域番号 |
26462259
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
早乙女 進一 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (20401391)
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| 研究分担者 |
大川 淳 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30251507)
吉井 俊貴 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 講師 (50583754)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 骨髄間葉系幹細胞 / 骨形成抑制因子 / 骨再生 |
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| 研究実績の概要 |
以前実施したマイクロアレイによる継代培養により遺伝子発現が亢進する因子のうちから、骨形成を抑止している可能性があると考えられる5因子を選択した。各因子に対しノックアウトするツールとしてCRIPSRシステムを、過剰発現させるツールとしてレンチウィルスベクターを作製することにした。
【骨形成抑制因子の候補因子をノックアウトするためのCISPR-Cas9の作製】Webツールを用いて、骨形成抑制因子候補に対するガイドRNA配列を設計し、pSpCas9(BB)-2A-GFPに挿入し、ガイドRNAとCas9配列を含むプラスミドベクターを各候補遺伝子につき、4種類ずつ作製した。
【骨形成抑制因子を過剰発現させるためのレンチウィルスベクターの作製】前記の骨形成抑制因子の候補因子のcDNAをHEK293細胞から作製し、Gatewayシステムを用いてレンチウィルスベクター（CSII-CMV-RfA-IRES2-Venus）に組み込んだ。
【ノックアウト骨髄間葉系幹細胞（MSC）の作製】細胞バンクより遺伝子導入により不死化したヒト間葉系幹細胞を3種類入手した。これらの細胞に対し、上記ツールを用いてノックアウトと過剰発現を試みた。しかしながら、予想通りレンチウィルスによる遺伝子導入の効率は低いだけでなく、細胞間で導入効率に大きな差が認められることが確認された。また、リポフェクション法にてCRISPRベクターの導入を試みたが、著しく導入効率が低いことが確認された。そこで、不死化細胞であることのメリットを活用し、各候補因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンを作製し、骨分化能に対する影響を評価することとした。現在、入手した各不死化MSCに関して、各因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンの作製を進めている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
作製したCRISPRベクターやレンチウィルスの導入効率が低いため、各因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンの作製に予想以上に時間がかかっているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
各候補因子の過剰発現クローン、ノックアウトクローンが作製され次第、各因子がMSCの骨芽細胞分化に与える影響などに関して、解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞培養に必用な血清を追加購入するにあたり、製品ロットを選択するために複数ロットのテストを行う必要がある。このテストが年度を越えてしまったため、年度内に予算を使用し切れなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
2015年5月時点で、ロット選択のためのテストは完了しているので、前年度から繰り越して翌年度分として請求した助成金は血清購入に使用する。
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