| 研究課題/領域番号 |
26462340
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
北野 敬明 大分大学, 医学部, 教授 (20211196)
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| 研究分担者 |
徳丸 治 大分大学, 医学部, 准教授 (40360151)
古賀 寛教 大分大学, 医学部, 助教 (50468013)
江島 伸興 大分大学, 医学部, 教授 (20203630)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 脳保護作用 / 水溶性ビタミンE誘導体 / 核磁気共鳴法 / 虚血－再灌流傷害 / 電子スピン共鳴法 / 高エネルギー燐酸 / フリーラジカル / スピントラップ法 |
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| 研究実績の概要 |
１．燐を観測核とする核磁気共鳴法（31P-NMR）による脳エネルギー代謝の測定
31P-NMRにより，脳虚血－再灌流傷害の前後におけるラット大脳スライスの高エネルギー燐酸を定量し，水溶性ビタミンE誘導体であるEPCK1及びETSGSの脳保護作用を検討した。虚血－再灌流傷害からのクレアチン燐酸の回復を測定したところ，いずれも1 mMにおいて対照群と比較して有意に良好な回復が認められた。0.01 mMおよび0.1 mMではその効果はみられず，EPCK1及びETSGSが濃度依存的な脳保護作用をもつことがエネルギー代謝の視点から示唆された。
２．フリーラジカル消去能の電子スピン共鳴法（ESR）による評価
水溶性ビタミンE誘導体であるETSGSのフリーラジカル消去能を，DMPO及びCYPMPOをスピントラップ剤とするESRにより測定した。酸素ラジカルであるヒドロキシルラジカル（IC50 = 20 mM），スーパーオキサイドアニオン（60 mM），アスコルビルフリーラジカル（20 mM），t-ブチルペルオキシルラジカル（2 mM）及び窒素ラジカルである一酸化窒素（3 mM），DPPH（0.8 mM）に対して消去能が認められた。チオバルビツール酸反応物質法による評価では，ヒドロキシルラジカル（8 mM）及び炭素ラジカル（IC50 推定不能）をイニシエータとする脳組織の脂質過酸化に対して抗酸化能が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り，31P-NMRを用いて，正常脳組織スライスの虚血－再灌流傷害に対する水溶性ビタミンE誘導体の脳保護効果の評価を行った。この結果，水溶性ビタミンE誘導体のEPCK1及びETSGSは，エネルギー代謝の側面から濃度依存性の脳保護作用をもつことが明らかになった。
また，ESRによるフリーラジカル消去能の評価については， ETSGS が６種類のフリーラジカルに対して直接的の消去能をもち，抗酸化剤として作用することを明らかにした。現在，EPCK1のフリーラジカル消去能の評価を実施中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
31P-NMRによる脳エネルギー代謝の研究は， アストロサイトに対して選択的毒性をもつフルオロクエン酸を用いてニューロンリッチな脳組織スライス標本を作製し，水溶性ビタミンE誘導体の虚血－再灌流傷害に対する脳保護作用において神経細胞とグリア細胞がそれぞれどのような役割をもつか，明らかにする。
フリーラジカル消去能のESRによる評価については，EPCK1のフリーラジカル消去能の検討を引き続き行う。また，評価の対象となるフリーラジカル種の種類をさらに増やして引き続き評価を実施する。また，当初の予定通り，脳スライス灌流モデルにおいて，虚血－再灌流負荷に伴って組織内で発生するフリーラジカル種のin situでの検出を目指す。
さらに，電気生理学的手法を用いて，神経機能面からの脳保護作用の評価を追加して行う準備に取り掛かっている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
EPCK1のフリーラジカル消去能および抗酸化能の評価が遅れたため，消耗品の購入費が当初見込んだよりも少なかったため。また，国内学会への参加も当初の予定より少なかったため，旅費の使用も予定額を下回った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初の予定通り，フルオロ酢酸など<sup>31</sup>P-NMRの実施に必要な試薬類の購入やESRのスピントラップ剤であるDMPOやCYPMPO，ラジカル発生系の試薬など必要な試薬や，NMR用試験管，灌流用チューブ，ESR用ディスポーザブル扁平セル，など消耗品の購入費として使用する。また，研究成果を国内外学会で発表するための旅費としても使用する。
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