| 研究課題/領域番号 |
26462392
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
宮島 直人 北海道大学, 大学病院, 助教 (40581111)
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| 研究分担者 |
篠原 信雄 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90250422)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ユビキチン / 前立腺癌 |
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| 研究実績の概要 |
今回、TRIM68恒常発現・前立腺癌細胞株を作成した。作成方法を以下に示す。サブクローニングにてTRIM68 cDNAをPuromycin耐性レトロウィルスベクターに組み込み、作成したベクターをパッケージング細胞に導入しPuromycin耐性レトロウィルスを産生させた。産生させたレトロウィルスをアンドロゲン受容体発現前立腺癌細胞株（22RV1）へ感染させ、Puromycin添加により細胞を選択した。選択生存した細胞をTRIM68恒常発現・前立腺癌細胞株とし、免疫ブロット法にてTRIM68の過剰発現を確認した。継代を数回行った後、再び免疫ブロット法を行い、やはりTRIM68が22RV1細胞に恒常的に発現していることを確認した。作成したTRIM68恒常発現・前立腺癌細胞株22RV1を用いて、ルシフェラーゼアッセイにてアンドロゲン受容体の転写活性を調べた。アンドロゲン刺激により通常の22RV1細胞に比べてTRIM68恒常発現22RV1細胞において有意にアンドロゲン受容体の転写活性が上昇していることが判明した。
これによりTRIM68がアンドロゲン受容体の転写活性に関与していることを示すことができた。
今後、この細胞株の癌化に関連した表現型の解析を行い（細胞増殖能やコロニー形成能など）、さらに、マウス皮下に細胞株を注入し腫瘍を形成させる、いわゆるXenograft modelの実験を予定している。これによりTRIM68のInvivoにおける腫瘍形成能を解明する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫沈降法およびツーハイブリット法にてTRIM68が標的とする基質蛋白質の同定を予定していた。しかし、免疫沈降法ではTRIM68に結合する蛋白質（p300など）は同定可能であったが、ユビキチンアッセイにて実際TRIM68の基質（標的）蛋白質ではなかった。ツーハイブリット法においても、HSP90など非特異的な蛋白質は同定可能であったが、TRIM68に特異的に結合する蛋白質の同定には至らなかった。そのため、当初の研究計画よりはやや遅れているのが現状である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、核磁気共鳴（NMR）などを用いてTRIM68の立体構造解析を行い、Ring-fingerドメインのATP結合部位に適合する、細胞膜透過性の脂溶性化学合成物の解析、同定、作製を行う。その化合物は、ATP結合を競合的に阻害することでTRIM68の酵素活性を阻害すると考えている。作製した化合物が、実際に細胞レベルでTRIM68の酵素活性を競合的に阻害し、アンドロゲン受容体転写活性や細胞増殖を抑制することを確認する。その後、TRIM68が豊富に発現しているLNCaP細胞のXenograftマウスや前立腺癌発症マウスに投与し、その腫瘍抑制効果を検討したいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していたマウスを用いたXenograft modelの実験を初年度に遂行できなかったため、次年度にその実験を予定している。そのため次年度使用額が生じている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細胞株の維持費、抗体の購入、マウスの購入・維持費に使用を予定している。また、学会に積極的に参加予定なので、そこでの使用も考慮に入れている。
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