| 研究課題/領域番号 |
26462406
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
小中 弘之 金沢大学, 大学病院, 講師 (40334768)
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| 研究分担者 |
北川 育秀 金沢大学, 大学病院, 講師 (00452102)
角野 佳史 金沢大学, 大学病院, 助教 (10397218)
京 哲 島根大学, 医学部, 教授 (50272969)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 去勢抵抗性前立腺癌 / 再燃メカニズム / ユビキチン-プロテアソーム系 / NF-κB / 小胞体ストレス / UPR / シグナル伝達 / クロストーク |
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| 研究実績の概要 |
去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）に対する新規治療法の確立には，再燃メカニズムの解明は必要不可欠である．本研究の目的は，ユビキチン-プロテアソーム系という新たな観点から前立腺癌の再燃メカニズムを解明すると共に，ユビキチン-プロテアソーム系を創薬標的としたCRPC に対する包括的治療戦略の構築にある． NF-κB は転写因子の一つで，その活性化が癌細胞の増殖促進，アポトーシス抑制，血管新生誘導，転移浸潤能を引き起こすが，NF-κBは小胞体ストレスによっても活性化される．小胞体ストレスが加わると，細胞はUPR（unfolded protein response） のシグナル伝達が活性化することによってストレスから回避する一方で， 小胞体ストレスが過剰すぎる場合には，同防御システムで 対処しきれずアポトーシスが誘導される．これらのNF-κBとUPR のシグナル伝達経路がともにユビキチン-プロテアソーム系によって制御されていることより，CRPCにおける NF-κB とUPR のクロストークに関する基礎的及び臨床的意義について検討する．平成27年度は，平成26年度の前立腺癌における小胞体ストレスの状態，UPR 活性化のステータス，発現ベクターの構築，NF-κB 活性化阻害による殺細胞効果等の in vitroでの実験に加えて，in vivo実験に向けての準備を進めた．また，NF-κB とUPR 活性化における転写因子: XBP-1，p50-ATF6，ATF4 とのクロストークについて検討した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アンドロゲン依存性前立腺癌株 LNCaP，アンドロゲン非依存性前立腺癌株 PC-3，DU145，正常前立腺上皮細胞 PrEC，正常前立腺間質細胞 PrSC に対して， thapsigargin あるいは tunicamycin を用いて小胞体ストレスを誘導し，転写因子：XBP-1，p50-ATF6，ATF4 の発現，局在のプロファイルにつき，RT-PCR 法と Western-blot 法によって，mRNA とタンパク質レベルで検討した．しかし，癌化ヒト組織アレイ Human Neoplastic Tumor Tissue Microarray シリーズ（タカラバイオ社）の前立腺版を用いた，転写因子の発現，局在を検討したが，その結果については，もう一度再検討する必要がある．また，CMVプロモーターによる XBP-1，p50-ATF6，ATF4 の発現ベクター： pCMV-XBP-1, pCMV-p50-ATF6, pCMV-ATF4 の構築がうまくいかず， UPR と NF-κB のクロストークの検討および，NF-κB の活性阻害による in vitro 殺細胞効果の検討は次年度以降となる．
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| 今後の研究の推進方策 |
まず，pCMV-XBP-1, pCMV-p50-ATF6, pCMV-ATF4の構築を完了させ，LNCaP，PC-3，DU145における小胞体ストレスによって誘導されるUPR転写活性が，NFκBのシグナル伝達を抑制するか否かを検討する．次に，NF-κBプロモーター活性については，以前構築した pGL3-3xκB-Lucを用いてルシフェラーゼアッセイにて検討する．また，pGL3-3κB-Luc と各pCMV-XBP-1, pCMV-p50-ATF6, pCMV-ATF4を前立腺癌細胞株に共導入してNF-κB プロモーター活性も評価する．また， NF-κB活性の阻害実験を，1) ドミナントティブ，2) デコイ，3) siRNA, 4) プロテアソーム阻害薬を用いて，以前樹立したLNCaP-SF細胞（アンドロゲンフリーでの培養維持株）及び LNCaP-κB細胞（p65の強制発現株）を用いて，殺細胞効果を WST-assay にて比較検討する．さらに，殺細胞効果が認められた細胞におけるアポトーシスの有無も解析する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度は，計画していた研究の進捗に大幅な遅れがあったために，本年度に使用予定であった研究費に残高が生じてしまい，次年度以降の研究費として繰り越されることになった．特に，研究費の大部分を要する癌化ヒト組織アレイの前立腺版を用いた再検討や，業者に作製を委託するsiRNA を用いたNF-κB の活性阻害実験が未施行であったことが，次年度使用額が生じた理由として大きいと考える．平成28年度以降は，今年度の反省を踏まえて，迅速な研究計画の遂行と研究費の効率的な運用を心がける次第である．
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に実施予定であった癌化ヒト組織アレイの前立腺版を用いた再検討や，業者に作製を委託するsiRNA を用いたNF-κB の活性阻害実験の消耗品および試薬に使用する予定である。
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