| 研究課題/領域番号 |
26462471
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
井原 基公 東北大学, 大学病院, 助教 (50403506)
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| 研究分担者 |
宇都宮 裕貴 東北大学, 大学病院, 准教授 (10359507)
立花 眞仁 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 非常勤講師 (30431571)
坂本 雅弘 東北大学, 大学病院, 技能補佐員 (50645299)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | SUMO / 加齢卵 / Bnc1 |
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| 研究実績の概要 |
卵母細胞の成熟過程における卵胞発育障害は早発閉経や高齢不妊患者において治療困難な病因であり、それらの大半は原因不明である。GV期卵母細胞の核小体様構造(NLB: Nucleolus-like body)は片親（卵母細胞）からのみに由来し、NLBが欠損すると第一分割で染色体分離異常を示す。したがって、加齢による受精率・胚発生率の低下や染色体不分離の原因の一端は、NLBの質的変化・構造変化によって引き起こされる可能性がある。タンパク質翻訳後修飾の制御破綻はさまざまな病因・病態に深く関与するが、卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾がどのようにNLBの機能を制御しているか不明である。本研究は卵母細胞特異的なNLB構造とNLB構成因子の翻訳後修飾SUMO化に焦点を当て、SUMO化による細胞機能の制御機構を分子レベルで解析し、不妊症の原因の一端を明らかにすることを目的としている。今年度に得られた知見は以下の通りである。
生殖細胞とkeratinocyte特異的に高発現するBasonuclin1 (Bnc1)が、マウス卵母細胞において転写活性が高い場合にNLBに局在することを明らかにした。FCS血清や成長因子EGFは細胞培養に必要であるが、単独ではBnc1の局在変化に影響しなかった。C末にGFPを付加したBnc1-GFPをGV期卵母細胞に発現させた場合、通常では細胞質に局在し、核内に移行しないことが判明した。これまでにBnc1がSUMO化(SUMO-1とSUMO-2)されることを明らかにしていたが、SUMO化コンセンサス配列以外の配列でSUMO-2/3が翻訳後修飾することが判明した。
また、質量分析器を用いてBnc1結合因子を探索したところ、核小体に局在する脱SUMO化酵素が結合することが判明した。従って、NLBにおいてSUMO化反応が重要な機能を有していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NLB(Nucleolus-like body)の収集をする前に興味深いデータが得られた。我々も含め、SUMO化(small ubiquitin-related modifier)がRNAのスプライシングなど、RNAプロセッシングの制御にも関わることを示してきたが、細胞特異的に制御されるRNAプロセッシングについては報告がなかった。また、SUMO化されるタンパク質は数多く存在するため、yeast two hybrid法などの解析方法を用いるとSUMO化タンパク質結合蛋白質の同定は困難である。今回思いがけず逆相HPLC/MS質量分析で核小体に局在する脱SUMO化酵素がNLB局在タンパク質結合蛋白質として同定されたので、実験の方向性は間違っていないと考えている。加齢卵の収集は時間的にも労力的にも困難を極めるので、週齢6週～8週マウスの卵母細胞を用いてある程度の結果を出しておく必要がある。生殖細胞特異的に高発現している蛋白質がNLBに局在することを見出したのは予定通りであり、更にこの蛋白質が様々なSUMO化修飾を受けることが判明したことはSUMO化自体の研究においても細胞生物学的に非常に意義がある。但し生殖細胞特異的に高発現しているBasonuclin1 (Bnc1)は転写活性が高い場合にNLBに局在するため、GV期の卵母細胞を単純に用いるだけではSUMO化の生理的意義を解明するまでには至らないので現在解析中である。また、これまでNLB内に局在するNucleoplasmin2(NPM2)はNLB構造上抗体で検出することはできなかったが、染色方法を改善することでNLB内のNPM2を検出することができるようになった。すなわちより良いNLB染色法を見出したことは意義がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
卵母細胞の培養条件は歴史的にも依然試行錯誤して探索中である。顆粒膜細胞を除去したGV期の成熟卵母細胞を用いた場合、転写やRNAプロセッシングが抑制されていると考えられるため、転写活性が高い場合にNLBに局在する蛋白質の機能を解析する場合、上述したように実験上の制約が生じた。そのため、転写活性を恒常的に活性化させる条件を確立する必要性があり、現在その条件を検討中である。また、同様な理由から、培養細胞を用いて生化学的にSUMO化の解析を行うが、順調に結果が出ているで、方針を変えず予定通り引き続き解析を続ける。また、卵母細胞において新規結合蛋白質が同定されているので、それらの蛋白質を同時に解析することで卵母細胞成熟に必要な細胞内シグナル伝達経路の一端を解明する予定である。
最近、次世代型シークエンサーや質量分析器を用いた解析方法やアプリケーションソフトは飛躍的に向上しつつある。そのため、それぞれの専門家と十分協議してタンパク質やRNA精製の方法を再検討する必要があり、そのための条件設定を行う。現在のところ、NLB蛋白量は想定よりも大量に必要そうで、計画の見直しが必要になる可能性がある。卵母細胞を用いるので、今後より定量のサンプルでも解析可能なプロトコールが発表された場合、後戻り可能であれば計画を変更する予定である。
ヒト３８～４５歳に相当する６０～７０週齢マウスを使用するまでには1年半の飼育が必要であるので、当初の計画を遂行するためにマウスを飼育中である
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度請求額と合わせ、平成27年度の研究遂行に使用する予定である。
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