| 研究課題/領域番号 |
26462520
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
山本 英子 名古屋大学, アジアサテライトキャンパス学院(医), 特任准教授 (10432262)
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| 研究分担者 |
柴田 清住 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90335026)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 絨毛癌 / hCG / 糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
絨毛癌細胞JarにGnT-IVaを過剰発現させるためのネオマイシンを選択マーカーとするベクターを、GnT-IVa/pSVLベクターを用いて作成した。Jarへの遺伝子導入後、ネオマイシンでセレクションを行った細胞において、GnT-IVa発現増強をWestern blotで確認した。
GnT-III発現抑制を行うため、MSCV（Murine Stem Cell Virus）プロモーター型レンチウイルスベクターを用いてshRNAベクターを3種類作成した(pSI-MSCV-CLXPpuro-H1R-GnT-III sh1,2,3)。絨毛癌細胞Jarに遺伝子導入、puromycinにてselectionを行った細胞をWestern blot法によりGnT-IVaの発現抑制が十分であることを確認した。gnT-IVa過剰発現絨毛癌細胞（Jar/GnT-IVa)にGnT-III shRNAベクターを導入し、ピューロマイシンにてセレクション後、GnT-IVa過剰発現/ＧｎＴ－ＩＩＩ発現抑制絨毛癌細胞を樹立した。
培養上清を用いたhCGおよびGSL-IIによるサンドイッチELISA法の確立に向けて、GnT-IVa発現抑制(GnT-IVa KD)Jarおよび親株Jarの培養上清を用いてプレリミナリーにサンドイッチELISAを行った。1/1～1/1000の濃度のhCG抗体とJar培養上清(親株:GnT-IVa KD=1：0～1:100）を、プレート下面接着と反応液とする2方法を行い、GSL-IIレクチン、マウス2次抗体を用いたサンドイッチELISAを行った。いずれにおいても反応は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度に予定していた絨毛癌組織におけるhCGサブユニット遺伝子のドミナントサブタイプの同定は、絨毛癌組織が手術検体として得られなかったため行うことができなかったが、平成27年度予定のサンドイッチELISAを先にはじめることができたため、研究の進行としてはおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
サンドイッチELISAに関しては、条件設定の試行を繰り返して検出できる条件を求めていく。絨毛癌組織の入手が困難であれば、細胞株により同様の実験を予定する。
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