| 研究課題/領域番号 |
26462600
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大和谷 崇 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (60334984)
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| 研究分担者 |
峯田 周幸 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40190714)
三澤 清 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (90334979)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 脱メチル化 / 5-ヒドロキメチルシトシン |
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| 研究実績の概要 |
エピジェネティック修飾のひとつであるDNAメチル化は，遺伝子発現の抑制やゲノム安定性の維持に必須である．これまでDNAメチル化の解析は詳細に行われていたが，DNAのメチル基を消去する分子基盤(DNA脱メチル化)は不明であった。最近、DNA脱メチル化酵素として機能する可能性をもつTetタンパク質が着目され、そのDNA脱メチル化活性に依存して生成される5-ヒドロキメチルシトシンが検出された。
今回我々は、2012年に開発されたTet-assistバイサルファイト処理を使った脱メチル化解析を行い、今まで困難であったDNA脱メチル化(5-ヒドロキメチルシトシン)状態を検出する方法の導入を行い頭頸部癌のエピゲノム異常の知見を蓄積していきたい。
1μgのDNAを、前処理としてT4-β-glucosyltransferase(βGT)にて、hmCの-CH2OH基にグルコシル化処理を行い，Tet1 oxidation reagentによるカルボキシル化から保護処理をし、Tet1 oxidation reagentによりmCのみにカルボキシルシトシン（caC）への変換を行ったのち、Traditional Bisulfite法と同じ亜硫酸水素塩処理を行い、非メチル化CとcaCをウラシルに変換する。hmCは、hmCとして変化を受けない。
Tet-assist Bisulfite 法によるシークエンスにより3番4番のCpGがTに変化していたら、そのCpGはmCと判別され、CのままであればhmCとなる。Traditional Bisulfite法とTet-assist Bisulfite 法の2手法をおこなってどちらもシークエンスし比較することでmCかhmCの判定を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Traditional Bisulfite法とTet-assist Bisulfite 法の2種類の方法で処理したサンプルで、PCRの立ち上がり(Ct値)に差がある場合、このサンプルは脱メチル化がおこっていると判断されが、今までの結果では安定した脱メチル化は起こっていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は脱メチル化検出キットを変更し実験を行っていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究は少し遅れているが、実験を進行している。来年度は本年度の分の研究費を使用できる予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
新しい脱メチル化キットを使用して実験を行う予定である。
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