眼慢性移植片対宿主病における老化細胞とドナー間葉系幹細胞の役割と治療法の開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26462668
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 小川 葉子 慶應義塾大学, 医学部, 特任准教授 (30160774)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ドライアイ / 間葉系幹細胞 / マクロファージ / 慢性移植片対宿主病 / 線維化 / 免疫応答

研究実績の概要

平成26年度は眼慢性移植片対宿主病（GVHD)におけるドナー間葉系幹細胞（MSC)由来線維芽細胞と老化マクロファージの局在の解明を主な目的として研究を推進した。
ドナーMSCとマクロファージの相互作用による眼GVHDの発症機構と病態形成の検討を追究するために下記検討を行った。
a) 全骨髄細胞移植(ドナーB10.D2マウス，レシピエントBALB/cマウス)を標準の移植とし (Zhang Y, et al. J Immunol, 2002)、GVHDに酷似した経時的炎症と線維化形成の作成をGVHD標的臓器で確立した。
b) 次にドナーMSCまたはマクロファージのみをGFP B10.D2マウス骨髄細胞から分離し、造血細胞をレシピエント由来の野生型BALB/cマウス骨髄細胞から分離し, 各細胞を同時にBALB/cレシピエントに移植した。移植後のMSCおよびマクロファージ浸潤細胞数、それぞれの細胞の局在、酸化ストレス及びp16 INK4A発現の検討を涙腺、結膜を用いて調べ、対照と比較した。MSC由来線維芽細胞にHSP47を、マクロファージにCD68をマーカーとして選択し検出した。
全骨髄細胞移植後にXenoLight Rediject Inflammation Probeをレシピエント腹腔内投与し、発光する炎症細胞を可視化して対照と比較してGVHDにおいてマクロファージを中心とした炎症細胞の浸潤が対照に比して亢進していた。病理学的解析を併せ解析し、眼GVHD発症早期より老化マーカーp16を発現するマクロファージが涙腺および他の標的臓器に浸潤していることを確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成26年度は１） 眼GVHDにおけるドナーMSCとマクロファージの局在と相互作用について検討した。ドナーMSCの局在は涙腺導管周囲に認められ、マクロファージは病態発症初期の毛細血管内とその周囲に認められドナーMSCと相互作用を行っている可能性を見出した。当該年度の研究は順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

眼慢性移植片対宿主病におけるMSCと老化マクロファージの相互作用による免疫応答と線維化形成における分子機構の解明を予定している。
a)マウスGVHDモデルの免疫応答を調べるため、末梢血炎症関連サイトカイン、制御性T細胞数の推移を移植前よりprospective に検討する。各分子の涙腺組織での発現と、MSC移植数およびp16陽性マクロファージ数の関連性を確認する。
ひとおよびマウス涙腺組織には老化マーカーp16を発現する炎症性細胞浸潤を認めている。酸化ストレスを発現するマクロファージの浸潤（Kawai M, Ogawa Y, Sci Rep, 2013)の血液、組織での炎症性サイトカイン、制御性T細胞数の変化との関連を確認する。
b)　ドナーおよびレシピエントのマクロファージとMSCを共培養し、培養上清のELISA にてサイトカイン、ケモカイン、酸化ストレス を対照と比較検討する。他の検討方法として、マクロファージが分泌すると考えられるケモカインの存在下でのドナーMSCの遊走能を検討する。
c) 診断のために得られたヒト涙腺、結膜組織切片についても、老化マクロファージとMSCの局在と病態への関連の検討をする。

次年度使用額が生じた理由

。最後に未使用の9788円が残りましたが実験計画は順調にすすみました。残額は使用せず平成27年度に繰り越して今年度必要な消耗品に使用させていただきます。

次年度使用額の使用計画

消耗品に使用予定です。

研究成果

• [雑誌論文] Comparisons for grading chronic ocular graft-versus-host disease: NIH eye score, Japanese dry eye score, and DEWS 2007 score. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tatematsu Y, Ogawa Y, Abe T, Kamoi M, Uchino M, Saijyo-Ban Y, Yaguchi S, Mukai S, Mori T, Okamoto S, Tsubota K.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 4 ページ: 6680
  • DOI: doi: 10.1038/srep06680
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Mice lacking inositol 1,4,5-trisphosphate receptors exhibit dry eye. (2014)
  • 著者名/発表者名: Inaba T, Hisatsune C, Sasaki Y, Ogawa Y, Ebisui E, Ogawa N, Matsui M, Takeuchi T, Mikoshiba K, Tsubota K
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e99205
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0099205. eCollection 2014
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Primary and secondary surveys on epidemiology of Sjogren's syndrome in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsuboi H, Asashima H, Takai C, Hagiwara S, Hagiya C, Yokosawa M, Hirota T, Umehara H, Kawakami A, Nakamura H, Sano H, Tsubota K, Ogawa Y, Takamura E, Saito I, Inoue H, Nakamura S, Moriyama M, Takeuchi T, Tanaka Y, Hirata S, Mimori T, Yoshifuji H, Ohta A, Matsumoto I, Sumida T
  • 雑誌名: Mod Rheumatol. 巻: 24 ページ: 464-470
  • DOI: doi: 10.3109/14397595.2013.843765. Epub 2013 Nov 5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Macrophage expressing oxidative stress marker play some role in lacrimal gland of chronic graft-versus-host disease (2014)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Y, Shimmura S, Suzuki T, Kawai M, Tsubota K.
  • 学会等名: The Annual Meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology 2014 (ARVO2014)
  • 発表場所: Orlando, USA
  • 年月日: 2014-05-02 – 2014-05-06
• [学会発表] Comparison of 3 Measurement Scales for Grading Ocular Chronic Graft-Versus-Host Disease Patients (2014)
  • 著者名/発表者名: Tatematsu Y, Ogawa Y, Abe T, Kamoi M, Uchino M, Saijyo-Ban Y, Yaguchi S, Mori T, Okamoto S, Tsubota K.
  • 学会等名: World Ophthalmology Congress of the International Council of Ophthalmology (WOC2014)
  • 発表場所: Tokyo, Japan
  • 年月日: 2014-04-02 – 2014-04-06
• [学会発表] [IS-SA-167] New Concepts in Ocular Surface Inflammation. The Role of Donor Mesenchymal Stem Cells in cGVHD (2014)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Y
  • 学会等名: World Ophthalmology Congress of the International Council of Ophthalmology (WOC2014)
  • 発表場所: Tokyo,Japan
  • 年月日: 2014-04-02 – 2014-04-06
• [図書] シェーグレン症候群の診断と治療マニュアル 改訂第2版 監修 住田孝之, 川上 純 編集 シェーグレン症候群学会 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小川葉子, 坪田一男.
  • 総ページ数: 総ページ数 216 頁 (86-93の13ページ担当）
  • 出版者: 診断と治療社
• [図書] 今日の治療指針2014年版 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小川葉子.
  • 総ページ数: 総ページ数 2014頁 (1314-1316）の3ページ担当）
  • 出版者: 医学書院
• [図書] 小児科 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小川葉子.
  • 総ページ数: 総ページ数 370頁 (287-295）の9ページ担当）
  • 出版者: 金原出版株式会社
• [図書] 専門医のための眼科診療クオリファイ 21 眼救急疾患スクランブルシリーズ 総編集 大鹿哲郎, 大橋裕一, 坂本泰二 初版 第一刷 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小川葉子, 小澤洋子.
  • 総ページ数: 総ページ数 380頁 (264-268）の5ページ担当）
  • 出版者: 中山書店