| 研究課題/領域番号 |
26462691
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
白石 敦 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90314963)
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| 研究分担者 |
小林 剛 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座助教 (70380285)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 角膜上皮細胞 / 再生医療 / 形質転換 |
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| 研究実績の概要 |
初年度では、１）生直後のK12Cre/RTGマウス背部皮膚からHoechst 33342にて染色後、cell sorter により表皮sp細胞の分離を行い、特異的未分化マーカー(α6-integrin, CD34)の発現をreal-time PCRで確認した。２） 野生型（C57BL/6）マウスから摘出し、上皮を除去した角膜実質上にK12Cre/RTGマウス由来の表皮sp細胞を播種し、角膜上皮細胞への形質転換の確認を、K12の発現に伴うGFPの発現を蛍光顕微鏡下で繰り返し確認した。
2年目には、すでに角膜輪部実質細胞で高発現していることを確認している5種類のWntシグナル関連因子（Sfrp2，Dkk3，Sostdc1，Wif1，Wnt16）の影響を確認した。１）プラスティック培養皿上に播種したK12Cre/RTGマウス由来の表皮sp細胞に種々のWntシグナル関連因子を添加してK12の発現をン確認したが、K12の発現は認められなかった。２）羊膜上に播種したK12Cre/RTGマウス由来の表皮sp細胞に種々のWntシグナル関連因子を添加してK12の発現を確認したが、K12の発現は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究ではWntシグナル関連因子の形質転換への影響を試みているが、これまでに試みた試験では、形質転換は確認できなかった。これまでの試験と、他方からの知見により形質転換医はWntシグナルにより誘導される因子が関与している可能性が示唆されてきた。そこで、本研究においても形質転換医関わる因子の再探索を行う予定とする。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々の検討した因子は、おもにWntシグナル抑制因子であり、WntシグナルまたはWnt シグナルに誘発される因子が、形質転換に関与している可能性がある。そこで、今年度には3次元培養法を導入して、さらなる形質転換に必要な用件を探索する。具体的方法として
１）ヒト角膜実質より単離された輪部角膜実質細胞、角膜実質細胞（中央部）およびヒト皮膚実質細胞をコラーゲンゲル内に培養する。
２）１）で培養したコラーゲンゲル状を羊膜で被い、さらにウサギ角膜上皮細胞を培養する。
３）1）作製したコラーゲンゲル上、２）で作製した3次元培養から羊膜+上皮細胞を剥離したコラーゲンゲル状、さらに上皮細胞を剥離したヒト角膜輪部上にK12Cre/RTGマウス由来の表皮sp細胞を播種し、形質転換を試みる。
４）この方法により、少なくともヒト角膜輪部上においては形質転換がおこると推測され、また、ヒト角膜輪部実質細胞を用いた3次元培養でも形質転換の可能性が推測される。そこで、形質転換に必要な因子の検索のため、3条件を選出して実質細胞に発現している、遺伝子およびタンパク質の検索を行う。
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