虹彩由来の組織幹/前駆細胞・不死化細胞・iPS細胞を用いた網羅的網膜再生研究

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26462701
• 研究機関: 藤田保健衛生大学
• 研究代表者: 山本 直樹 藤田保健衛生大学, 共同利用研究推進施設, 准教授 (00267957)
• 研究分担者: 谷川 篤宏 藤田保健衛生大学, 医学部, 准教授 (40324412) ; 大熊 真人 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (50329710) ; 堀口 正之 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (70209295) ; 宮地 栄一 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (90129685)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 虹彩由来iPS細胞 / 網膜幹／前駆細胞 / 網膜再生 / 電気生理 / 不死化細胞 / 組織幹細胞 / 再生医療

研究実績の概要

本研究は、これまでに我々が独自に樹立・報告した虹彩に存在する虹彩由来組織幹／前駆細胞、虹彩由来不死化細胞および虹彩由来iPS細胞を用いた網膜神経細胞への分化機構を明らかにするトランスレーショナルリサーチとして、再生医療などへの応用性や可能性をもつ３種類の細胞を網羅的に利用して取り組む網膜神経の再生に関する基礎研究である。
１）本研究期間において新たに樹立したヒト虹彩組織由来iPS細胞を用いて、より詳細なクローニングを行い、最も増殖能と未分化能が維持された虹彩由来iPS細胞株を樹立した。樹立した虹彩iPS細胞株をEB体（細胞凝集体）形成実験を行い、三胚葉へ分化することを確認した。次に接着培養法にて新たな２ステップの分化誘導方法を樹立した。分化誘導の１段階目において、神経幹／前駆細胞マーカーであるNestin、Musashiを強発現する細胞に分化させることができた。次に２段階目の分化誘導法にて複数の神経細胞マーカーを発現する細胞に分化誘導させることができた。これらの細胞を、電気生理学的手法であるホールセルパッチクランプ法にて検証したところ、神経細胞に特異的に発現するナトリウムチャネルの発現を発現する神経細胞であった。
２）平成27年度に新たに作出した虹彩由来不死化細胞を用いて、虹彩由来iPS細胞同様に神経細胞への分化誘導を行った。新たに作出した虹彩由来不死化細胞は、独自に開発した不死化細胞作出vectorにて作製しており、遺伝子導入前の細胞が元来から有しているDNAを損傷させることなく、現在の研究では機能していないDNA領域に不死化遺伝子を導入できる。虹彩由来iPS細胞と同様に神経細胞への分化誘導が可能であったと考えられる。
３）虹彩由来組織幹／前駆細胞の維持培養法を検討した。複数の阻害剤を組み合わせることにより、さらに安定した虹彩由来組織幹／前駆細胞を培養することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] 新たな手法で作出した不死化細胞による医薬品・医薬部外品の評価． (2017)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 雑誌名: 眼薬理 巻: 31 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of a new immortalized human corneal epithelial cell line (iHCE-NY1) for use in evaluating eye irritancy by in vitro test methods. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto N, Kato Y, Sato A, Hiramatsu N, Yamashita H, Ohkuma M, Miyachi E, Horiguchi M, Hirano K, Kojima H.
  • 雑誌名: In Vitro Cell Dev Biol Anim. 巻: 52 ページ: 742-748
  • DOI: doi: 10.1007/s11626-016-0038-9. Epub 2016 Apr 29.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell-surface protein profiling identifies distinctive markers of progenitor cells in human skeletal muscle. (2016)
  • 著者名/発表者名: Uezumi A, Nakatani M, Ikemoto-Uezumi M, Yamamoto N, Morita M, Yamaguchi A, Yamada H, Kasai T, Masuda S, Narita A, Miyagoe-Suzuki Y, Takeda S, Fukada S, Nishino I, Tsuchida K.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 7 ページ: 263-278
  • DOI: doi: 10.1016/j.stemcr.2016.07.004.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A lower volume culture method for obtaining a larger yield of neuron-like cells from mesenchymal stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimomura A, Iizuka-Kogo A, Yamamoto N, Nomura R.
  • 雑誌名: Med Mol Morphol. 巻: 49 ページ: 119-126
  • DOI: doi: 10.1007/s00795-015-0131-2. Epub 2015 Dec 23.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 【総説】 虹彩由来細胞を用いた網膜再生．－組織幹/前駆細胞・不死化細胞・iPS細胞を用いて－． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 雑誌名: BIO Clinica 巻: 31 ページ: 1166-1168
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] iPS細胞の培養で必要なフィーダー細胞の検討． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹、平松範子、山下宏美、大熊真人、宮地栄一、磯谷澄都、今泉和良、谷川篤宏、堀口正之、谷口孝喜
  • 学会等名: 第48回藤田学園医学会
  • 発表場所: 愛知県豊明市、フジタホール500
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-07
• [学会発表] 虹彩由来細胞を用いたiPS細胞作出と生理的機能を有する神経細胞への分化誘導． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹、大熊真人、平松範子、磯谷澄都、今泉和良、谷川篤宏、 宮地栄一、堀口正之
  • 学会等名: 第48回日本分子形態学会総会・学術集会
  • 発表場所: 熊本県熊本市、くまもと県民交流館パレア
  • 年月日: 2016-09-23 – 2016-09-24
• [学会発表] 新たな手法で作出した不死化細胞による医薬品・医薬部外品の評価． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 学会等名: 第36回日本眼薬理学会
  • 発表場所: 東京都板橋区、帝京大学板橋キャンパス
  • 年月日: 2016-09-10 – 2016-09-11
  • 招待講演
• [学会発表] 虹彩由来iPS細胞を用いた水晶体上皮細胞への分化誘導． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹、平松範子
  • 学会等名: 第55回日本白内障学会総会・第42回水晶体研究会合同学会
  • 発表場所: 岩手県盛岡市、いわて県民情報交流センター アイーナ
  • 年月日: 2016-07-29 – 2016-07-31
• [学会発表] ヒト不死化角膜上皮細胞を用いた三次元角膜モデルの有用性． (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹、平松範子、山下宏美、加藤義直、佐藤淳、中田悟、松井優子、真野陽介、原和宏、増藺夕紀子、中村政志、小島 肇
  • 学会等名: 日本組織培養学会第89回大会
  • 発表場所: 大阪府大阪市、千里ライフサイエンスセンター
  • 年月日: 2016-05-25 – 2016-05-26
• [備考] 藤田保健衛生大学研究支援推進センター共同利用研究施設
  • URL: http://www.fujita-hu.ac.jp/~kyoriken/research/reserachpage.html