| 研究課題/領域番号 |
26462705
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
吉田 英生 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60210712)
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| 研究分担者 |
齋藤 武 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20406044)
光永 哲也 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (80375774) [辞退]
上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究所長 (90262708)
照井 慶太 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (70375773)
中田 光政 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90375775)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 小児腫瘍学 / 神経芽腫 / 癌幹細胞 / side population / 免疫不全マウス |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度は、神経芽腫細胞株からのCD133陽性細胞分離・抽出効率を向上させながら、同細胞の(免疫不全マウスにおける)腫瘍形成能の検討に着手した。MYCN増殖株(IMR32,CHP134,LA-N-5)とMYCN非増幅株(SH-SY5Y)を継代培養(Hansford LM et al. Cancer Res 67:11234-11243,2007)し、Heochst33342にて処理後FACSにてSide Population(SP)を分離、次いでautoMACSでCD133陽性細胞を各株から抽出した。平成26年度の懸案事項であった回収効率は、継代培養頻度を1回/週から2回/週に増やし、proliferation mediumの組成を変更(グルタミン濃度を2倍に)することで改善され、回収されるCD133陽性細胞数はIMR32 7.2×103/ml, CHP134 6.2×103/ml, LA-N-5 2.4×103/ml, SH-SY5Y 4.7×103/mlに向上した(いずれもmean)。
これら細胞株群のうちIMR32とSH-SY5Yを選択し、sphere形成能と増殖曲線を比較した。IMR32では径200μmのsphere形成に平均6.4±3.2日、SH-SY5Yでは同8.5±3.1日を要し、IMR32で早期に形成される傾向が認められた(p=0.16)。一方増殖曲線を描くと、培養開始5日の時点で各2.6×104, 7.8×103個であり、5cmシャーレがconfluenceに達するまで各4日、6日(中央値, p=0.04)かかり、IMR32で増殖能が旺盛な結果が認められた。ただしいずれも実験回数は3回であり、次年度以降再現性を確認する必要がある。また親株との比較では各細胞群ともCD133分画で増殖能が有意に高いことが示唆された。
免疫不全マウスを用いた実験も開始しており、CD133陽性細胞と親株細胞を免疫不全マウス(NOD/SCID)の皮下と尾静脈に接種し、局所における造腫瘍能と、転移形成能をそれぞれ検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成27年度の当初の目標は、神経芽腫細胞株からのCD133分画の分離法を確立し、細胞株毎の同分画のcharacterizationを施行後、実験の主体をin vitroからin vivo実験に移行することであった。しかしながらcharacterizationのうち多分化能の検討(①神経成長因子を付加することでneurofilamentの発現状況から神経分化誘導を試みる、②forskolinによりグリアへの誘導をS100やGFAP発現状況で観察する、③neurotrophic receptorやchemokine receptorを検討する)を開始することができていない。主因はCD133細胞の作成効率が予想以上に低値であったことに存するが、平成27年度後半の実験で同問題は解決され、次年度に研究が大きく進展することが予想される。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度後半の実験により細胞の散布密度、培養液組成、増殖刺激付与のタイミングを調整することで、各細胞株からのCD133細胞作成効率は改善した。平成28年度は早期から多分化能を検討することが可能となっており、in vivo実験(マウスにおける腫瘍・転移形成能)と並行して行う予定である。
また進行神経芽腫患児の臨床検体を用い、神経芽腫原発巣と骨髄転移巣におけるCD133発現をPCR法で定量的に測定し、その局在を免疫組織染色で検討する。さらに細胞株実験で駆使したFACSとauto MACSの手法を応用し、患者採取組織からCD133 陽性細胞(癌幹細胞である可能性が示唆される)の分離を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では、平成27年度は各神経芽細胞株から分離したCD133陽性細胞の多分化能を検討する予定であった。すなわち①神経成長因子を付加することでneurofilamentの発現状況から神経分化誘導を試みる、②forskolinによりグリアへの誘導をS100やGFAP発現状況で観察する、③neurotrophic receptorやchemokine receptorを検討する、などに着手する予定であった。しかし前段階となるCD133細胞の作成効率が予想以上に低値であったため、分離細胞株のcharacterizationまで踏み込むことができなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度後半の実験により細胞の散布密度、培養液組成、増殖刺激付与のタイミングを微調整することで、各細胞株からのCD133細胞分離効率は改善した。平成28年度は早期から多分化能を検討することが可能となっており、in vivo実験(マウスにおける腫瘍・転移形成能)と並行して行う予定である。PCR関連試薬、細胞培養関連物品、実験試薬類など比較的高価なものが大量に必要であるため、平成27年度未使用分で補充する。
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