| 研究課題/領域番号 |
26462705
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
吉田 英生 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (60210712)
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| 研究分担者 |
齋藤 武 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (20406044)
光永 哲也 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (80375774) [辞退]
上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究所長 (90262708)
照井 慶太 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (70375773)
中田 光政 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90375775)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 小児腫瘍学 / 神経芽腫 / 癌幹細胞 / side population / 免疫不全マウス |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は神経芽腫細胞株のうちMYCN増幅群としてIMR32，MYCN非増幅群としてSH-SY5Yを使用し，sphere形成能と増殖能について再現性を確認した．また，免疫不全マウスを用いた同細胞の腫瘍形成能についての実験に着手した．CD133陽性細胞と親株細胞を免疫不全マウス（NOD/SCID）の皮下と尾静脈に接種し，局所における造腫瘍能と転移形成能をそれぞれ検討した．MYCN増殖株(IMR32,CHP134,LA-N-5)とMYCN非増幅株(SH-SY5Y)を継代培養(Hansford LM et al. Cancer Res 67:11234-11243,2007)し、Heochst33342にて処理後FACSにてSide Population(SP)を分離、次いでautoMACSでCD133陽性細胞を各株から抽出した。継代培養頻度を2回/週行い，proliferation mediumの組成をグルタミン濃度2倍にしたことで回収効率が上がった．IMR32とSH-SY5Yのsphere形成能と増殖曲線を比較した。IMR32では径200μmのsphere形成に平均6.5±3.1日、SH-SY5Yでは同8.7±3.3日を要し、IMR32で早期に形成される傾向が認められた(p=0.16)。一方増殖曲線を描くと、培養開始5日の時点で各2.7×104, 7.8×103個であり、5cmシャーレがconfluenceに達するまで各4日、6日(中央値, p=0.04)かかり、IMR32で増殖能が旺盛な結果が認められた。再現性も得られ，親株との比較では各細胞群ともCD133分画で増殖能が有意に高いことが示唆された。
免疫不全マウスを用いた実験ではCD133陽性細胞と親株細胞を免疫不全マウス(NOD/SCID)の皮下と尾静脈に接種し、局所における腫瘍増殖，肝臓・骨髄への転移形成を確認した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
平成28年度の当初の目標は、神経芽腫細胞株からのCD133分画の分離法を確立し、細胞株毎の同分画の多分化能の検討を行い，実験の主体をin vitroからin vivo実験に移行することであった。しかし，CD133陽性細胞の作成率は改善したものの，sphere形成能，増殖能の再現性を得ること時間を要し，再現性を確認するにとどまった．そのため，in vivoへの移行は進まず，in vivo実験ではまず，免疫マウスモデルの系が確立されていることの確認を行った．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度は研究計画を延長し，CD133陽性細胞の多分化能の検討(①神経成長因子を付加することでneurofilamentの発現状況から神経分化誘導を試みる、②forskolinによりグリアへの誘導をS100やGFAP発現状況で観察する、③neurotrophic receptorやchemokine receptorを検討する)を行い，in vivo実験を併行して行う．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では平成28年度は神経芽腫細胞株からのCD133分画の分離法を確立し、細胞株毎の同分画の多分化能の検討を行い，実験の主体をin vitroからin vivo実験に移行することであった。しかし，CD133陽性細胞の作成率は改善したものの，sphere形成能，増殖能の再現性を得ることに時間を要した．
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27-28年度の実験によりCD133陽性細胞の作成率は改善し，sphere形成能，増殖能の再現性が得られた．平成29年度は早期から多分化能を検討することが可能となっており、in vivo実験(マウスにおける腫瘍・転移形成能)と並行して行う予定である。PCR関連試薬、細胞培養関連物品、実験試薬類など比較的高価なものが必要であるため、平成28年度未使用分で補充する。
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