新規ヒルシュスプルング病モデルによる腸管神経ネットワーク形成機序の解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26462714
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 芝田 晋介 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70407089)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ヒルシュスプルング病 / 神経堤 / 幹細胞 / 腸管 / モデルマウス / 蛍光タンパク質 / 移植治療

研究実績の概要

出生後まもなく生じる腸管運動不全の中で最も患者数の多いヒルシュスプルング病は、発生初期の神経堤由来の腸管神経が欠損したり分化・移動障害を来したりすることによって生じることが知られている。基本的治療法は腸管神経欠損部分の切除術であるが、欠損部位の大きさによっては手術困難で死亡したり、術後の腸管運動障害が残ったりする。カハールの予言によりこれまで神経組織は一度損傷されると再生しないと信じられていたが、近年内在性幹細胞の存在が示され、様々な疾患で幹細胞移植により喪失機能が回復した報告がなされた。そこで自己複製能と多分化能を持つ神経堤由来の幹細胞を用いたヒルシュスプルング病の幹細胞治療を実現するために本プロジェクトを実施している。すでに計画(1)として正常腸管の神経堤由来細胞の未分化状態の解析を実施した。神経堤由来の細胞を緑色蛍光タンパク質でラベルしたトランスジェニックマウスにおける幹細胞や分化細胞のマーカー発現を確認し、計画(2)として、免疫電子顕微鏡観察を用いた正常腸管発生過程における神経堤由来細胞の解析を実施した。そして現在までに計画(3)にて新規ヒルシュスプルング病モデル動物開発のために、神経堤由来細胞が緑色蛍光タンパク質ラベルされたマウスを用いた薬剤性のヒルシュスプルング病モデルマウスを作成した。このモデルマウスがヒトの病態と極めて近い表現型を生後も継続的に示したことから、この成果を踏まえ計画(4)として薬剤性ヒルシュスプルング病モデル動物における神経堤由来細胞の分化状態の解析を行った。生後マウス腸管において神経堤幹細胞の維持や増殖が阻害された病態における、各種の腸管細胞群の分化・増殖および遊走能への影響について詳細に解析し、腸管運動機能への影響も定量的に評価できたことから、平成27年度に学術誌に論文として報告した。この成果を基に、次年度の研究計画を遂行したいと考える。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通りのスケジュールで研究を実施している。申請時には3年間で6つの項目の実験および解析を進め、腸管神経ネットワークの発生・分化メカニズムに迫る計画を立てていた。その計画通り、1年目に研究計画の(1)および(2)を実施し、2年目の平成27年度には、研究計画の(3)と(4)のデータ取得を順調に進めてられている。計画通りに進展していると考えている。
研究計画(1)正常腸管の神経堤由来細胞の未分化状態の解析,
研究計画(2)免疫電子顕微鏡観察を用いた正常腸管発生過程における神経堤由来細胞の解析,
研究計画(3)新規ヒルシュスプルング病モデル動物の開発,
研究計画(4)ヒルシュスプルング病モデル動物における神経堤由来細胞の分化状態の解析

今後の研究の推進方策

当初の申請時に計画した通り、平成28年度は研究計画(5)および(6)を実施するスケジュールを整えて実験を開始している。
研究計画(5)ヒルシュスプルング病モデル動物の神経堤由来細胞の免疫電子顕微鏡観察,
研究計画(6)ヒト腸管手術検体の神経節細胞の分化状態の解析

次年度使用額が生じた理由

計画通りのスケジュールで研究を実施したが、平成27年度に実施した新規モデル動物の作成のために、胎生致死となる遺伝子欠損によるヒルシュスプルング病モデル動物作成に優先し、産出効率の高い神経堤由来細胞を緑色蛍光タンパク質ラベルしたマウスを用いた薬剤性ヒルシュスプルング病モデルマウスを作成して論文を作成したため、結果的に飼育費が節減できた。

次年度使用額の使用計画

次年度は胎生致死である遺伝子欠損によるヒルシュスプルング病モデル動物を優先的に作出するために、胎仔作成用ヘテロマウスを大量に飼育しないと目的の遺伝子型の個体が得られないため、前年度から繰り越した研究費はマウス飼育費用に充てる。

研究成果

• [国際共同研究] Harvard University(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Harvard University
• [雑誌論文] Sustained Effect of Hyaluronic Acid in Subcutaneous Administration to the Cochlear Spiral Ganglion. (2016)
  • 著者名/発表者名: Inagaki Y, Fujioka M, Kanzaki S, Watanabe K, Oishi N, Itakura G, Yasuda A, Shibata S, Nakamura M, Okano HJ, Okano H, Ogawa K.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 11(4): ページ: e0153957.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0153957.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Fluorescence Visualization of the Enteric Nervous Network in a Chemically Induced Aganglionosis Model (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujimura T*, Shibata S*, Shimojima N, Morikawa Y, Okano H, Kuroda T. (*equally contributed first author)
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11(3):e0150579. ページ: 1-14
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0150579.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Applications of Mesenchymal Stem Cells and Neural Crest Cells in Craniofacial Skeletal Research. (2016)
  • 著者名/発表者名: Morikawa S, Ouchi T, Shibata S, Fujimura T, Kawana H, Okano H, Nakagawa T
  • 雑誌名: Stem Cells International 巻: 2016:2849879 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1155/2016/2849879.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Application of q-Space Diffusion MRI for the Visualization of White Matter (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujiyoshi K, Hikishima K, Nakahara J, Tsuji O, Hata J, Konomi T, Nagai T, Shibata S, Kaneko S, Iwanami A, Momoshima S, Takahashi S, Jinzaki M, Suzuki N, Toyama Y, Nakamura M, Okano H.
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience 巻: 36(9) ページ: 2796-2808.
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1770-15.2016.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Grafted human iPS cell-derived oligodendrocyte precursor cells contribute to robust remyelination of demyelinated axons after spinal cord injury (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawabata S, Takano M, Numasawa-Kuroiwa Y, Itakura G, Kobayashi Y, Nishiyama Y, Sugai K, Nishimura S, Iwai H, Isoda M, Shibata S, Kohyama J, Iwanami A, Toyama Y, Matsumoto M, Nakamura M, Okano H,
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 6(1) ページ: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2015.11.013.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kanzaki S, Watanabe K, Fujioka M, Shibata S, Nakamura M, Okano HJ, Okano H, Ogawa K.
  • 雑誌名: Hearing Research. 巻: 330(Pt A): ページ: 142-146
  • DOI: 10.1016/j.heares.2015.09.018.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immuno-Electron Microscopy and Electron Microscopic In Situ Hybridization for Visualizing piRNA Biogenesis Bodies in Drosophila Ovaries. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shibata S*, Murota Y, Yoshimura M, Nagai T, Okano H, Siomi MC*. (*co-corresponding author)
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 1328 ページ: 163-178
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2851-4_12.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] 電子顕微鏡による大規模高速コネクトミクス解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: Shibata S, Okano H, Lichtman JW,
  • 学会等名: 第121回日本解剖学会年会
  • 発表場所: ビックパレットふくしま(福島県郡山市)
  • 年月日: 2016-03-27 – 2016-03-30
  • 招待講演
• [学会発表] Application of the 3D-EM in Harvard and Keio University with ATUM (2015)
  • 著者名/発表者名: Shibata S
  • 学会等名: Array Tomography Workshop
  • 発表場所: Oxford (UK)
  • 年月日: 2015-10-07 – 2015-10-08
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Evaluation for the enteric ganglion cells with novel Hirschsprung's disease model (2015)
  • 著者名/発表者名: Shibata S, Fujimura T, Kuroda T, Okano H.
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-28 – 2015-07-31
• [学会発表] 電子顕微鏡を用いて蛋白質とRNAの局在を探る (2015)
  • 著者名/発表者名: Shibata S
  • 学会等名: 第140回 電子顕微鏡技術研究会
  • 発表場所: 東京大学医学部(東京都文京区)
  • 年月日: 2015-06-06 – 2015-06-06
  • 招待講演
• [学会発表] Approaches for brain connectomics (2015)
  • 著者名/発表者名: Shibata S, Okano H, Lichtman JW,
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会 第71回学術講演会
  • 発表場所: 国立京都国際会館(京都府京都市)
  • 年月日: 2015-05-13 – 2015-05-15
  • 招待講演
• [備考] 慶應義塾大学医学部生理学教室ホームページ
  • URL: http://www.okano-lab.com/publication