| 研究課題/領域番号 |
26462718
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
越永 從道 日本大学, 医学部, 教授 (70205376)
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| 研究分担者 |
杉藤 公信 日本大学, 医学部, 助教 (10328750)
藤原 恭子 日本大学, 医学部, 助教 (40595708)
古屋 武史 日本大学, 医学部, 助手 (20568539)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | メチル化 |
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| 研究実績の概要 |
前年度までに、細胞および組織における発現レベルの解析から新規ヒト小児肝芽腫・腎芽腫関連遺伝子の候補を6遺伝子に絞り込んだが、本年度はゲノムメチル化レベルの変化を調べることにより、この6遺伝子から更に絞り込みを行った。肝芽腫候補遺伝子4つと（A,B,C,D）、腎芽腫関連候補遺伝子2つ(E,F) のゲノムメチル化レベルをMassArray epityper 法による定量的DNAメチル化解析をしたところ、AおよびEが、それぞれ肝芽腫、腎芽腫の腫瘍細胞または組織において正常部と比べて異なったメチル化状態を示した。この結果より、我々は遺伝子A、Eをそれぞれ新規肝芽腫関連遺伝子、新規腎芽腫関連候補遺伝子とし、次の機能解析に進んだ。遺伝子Aの機能解析はヒト肝芽腫細胞株HepG2、Huh6 を用いて、遺伝子Eの機能解析は腎芽腫細胞株G401、SK-NEP-1を用いて解析することとした。それぞれ遺伝子AおよびEに対するsiRNAを用意し、knock down効率をこれらの細胞株を用いて調べた。また、各細胞株にプラスミドベクターを導入し、遺伝子A、Eの安定発現株の作製を試みている。いずれも、プラスミドをLipofection法で導入後、抗生剤存在下で培養し、それぞれの遺伝子を導入した細胞株のシングルクローンを15～30株ほど得た。その後、real-time PCRおよびウエスタンブロッティングにより導入遺伝子の発現量の定量を行っているが、作成現時点では、まだ安定発現株は樹立できていない。次年度は引き続き安定発現樹立を試み、それぞれの遺伝子高発現での腫瘍細胞の形態変化、機能の変化を解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MassArray epityper 法を用いた定量的DNAメチル化解析により新規肝芽腫・腎芽腫関連遺伝子の絞り込みが完了し、肝芽腫、腎芽腫におけるそれぞれの遺伝子の機能解析を行う準備に入ることができた。次年度は2個の遺伝子について、それぞれ肝芽腫、腎芽腫細胞株を用いて、平行して機能解析を行うが、解析を行う上でのノウハウやツールはすでに研究室内に整備されているため、問題なく研究が進行できると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
肝芽腫細胞株においては遺伝子A、腎芽腫細胞株においては遺伝子Eの発現をsiRNA でknock downもしくは、ベクター導入により安定発現させ、細胞の増殖能や遊走・浸潤能などの変化を検討する。前年度までに安定強制発現株の樹立が出来ていないことから、本年度も引き続き、安定発現クローンのスクリーニングを行い、それでも樹立ができない場合は、ベクターの種類を変えるなどの検討を行う。次年度の半ば頃までに安定発現株が樹立できなかった場合は、一過性の発現による機能解析を行う。培養系において有意な機能変化が観察でき、さらに、その遺伝子の安定発現株も樹立できた場合は、その細胞株を免疫不全マウス皮下に注入し、in vivo における増殖能、転移能について検討する。
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