| 研究課題/領域番号 |
26462731
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
松本 洋 岡山大学, 大学病院, 助教 (20423329)
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| 研究分担者 |
松下 治 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00209537)
杉山 成史 岡山大学, 大学病院, その他 (80379776)
美間 健彦 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80596437)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | リンパ管再生 / VEGF-C / 融合蛋白 |
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| 研究実績の概要 |
VEGF-C-コラーゲン結合ドメイン(CBD)融合タンパク質の生産系を確立した。当初、Brevibacillus分泌発現システムを用いて生産を行っていたが、精製後も挟雑蛋白が多かった。そのため、培養条件の検討やイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー等を試みたが、挟雑蛋白の除去には至らなかった。そのため、昆虫細胞（Sf-9）を用いた生産系へ変更した。昆虫細胞用のウイルスベクターを作成し直し、昆虫細胞に導入し融合蛋白を生産・精製した。挟雑蛋白は依然として認めるものの、絶対量は減少した。
次に、融合蛋白質のコラーゲン結合能を検査し、不溶性コラーゲンに対する結合能を確認した。さらに、培養リンパ管内皮細胞における融合蛋白の活性を調査した。通常の培養ではリンパ管内皮細胞に対するVEGF-C自体の増殖活性が評価出来なかった。そこで様々な条件検討をした結果、フィブロネクチンコーティング上で培養したところ、MTSアッセイにて何とか増殖活性が評価出来つつある。しかし、結果はまだ安定しておらず、さらなる検討を行っているところである。また、VEGF-Cがリンパ管内皮細胞増殖を活性化する細胞内MAPKシグナル伝達についても調査し、VEGF-C自体の活性は評価出来たが、融合蛋白の活性は調査中である。遊走活性やチューブ形成能に関しても調査を行っているが、VEGF-C自体の活性評価が今のところ出来ていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
培養細胞におけるVEGF-C自体の活性評価法が確立出来ていないため、融合蛋白の活性評価に苦慮している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、安定したVEGF-C活性評価法を確立するため、さらなる条件検討等を進めていく。また、同時に実験動物における活性評価も進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定よりも安く物品購入が出来たため、未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
培地、実験動物、コラーゲン基剤、免疫染色用試薬等の購入に使用する予定である。
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