| 研究課題/領域番号 |
26462756
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
泉 友則 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00261694)
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| 研究分担者 |
田岡 万悟 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (60271160)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 機能プロテオミクス / 細胞質漏出 / 細胞表面結合 / 炎症メディエーター / 疾患マーカー |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、申請者らがこれまでに特定した“細胞表面結合能を有する一群の細胞内タンパク質”について、細胞膜上での新たな分子機能を解析する。H26年度は、潜在的機能分子の選択、およびタンパク質調製、さらにU937細胞に対する影響解析を行った。
はじめに、既に同定した単球表面結合能を持つ168種類の細胞内タンパク質リストより、結合・漏出実験での質量分析データ、および既知の分子機能や疾患との関連に基づき、6種類の核酸結合タンパク質、5種類の代謝酵素、1種類のシャペロン、1種類の翻訳関連タンパク質、および2種類の疾患マーカーを含む15種類の潜在的機能分子を選択した。さらに、疾患プロテオーム解析データ（蘇生後脳症脳脊髄液）を精査し、これらのタンパク質が神経学的健常群において検出限界以下であることを確認した。15種類のタンパク質について市販の精製標品の購入を進めるとともに、5種類については、cDNAクローニングを終え、作製したタグ付発現ベクターへ組み込んだ。細胞影響解析は、100 nM のPMA で24時間刺激したU937細胞にLPS 10 ng/ml、および各タンパク質（0.1 mg/ml）を添加し、さらに24時間培養後、培地を回収し、培地中のサイトカイン（IL-6, TNF alpha）濃度を測定した。潜在的機能分子の細胞表面との相互作用に関しては、血清存在／非存在下で培養したU937細胞にタグ付きタンパク質（0.1 mg/ml）を添加し、4℃で15分間インキュベーション後、細胞、および上清を回収し、細胞表面に結合したタンパク質量をウエスタンブロットにより解析した。解析ごとに影響の有無を判定し、想定される分子機能の分類を行うとともに、引き続き、残りの潜在的機能分子についての活性測定実験を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、１）潜在的機能分子の選択とタンパク質調製、２）潜在的機能分子の細胞影響解析（サイトカイン産生）、３）潜在的機能分子の細胞影響解析（細胞運動）、４）単球表面における相互作用解析、以上4項目を実施計画に記載した。培養実験に必要なスペースの問題から、１）、２）、４）を先に開始し、３）についてはH27年度に開始することとした。いずれの項目も27年度までの継続実験を予定しており、活性測定データも着実に集積しつつあることから、おおむね計画通りの実施状況と言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
H27年度は、当初の研究計画に沿って、１）H26年度からの継続実験を進めるとともに、２）単球表面の相互作用分子の同定実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品購入の当初計画額からの値引きにより最終的に生じた残額（約3万円）であり、H26年度の研究費使用計画は、当初の研究計画から大きな変更はない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H27年度の予算と合算し、試薬・消耗品の購入に使用する。
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