| 研究課題/領域番号 |
26462786
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
岡村 裕彦 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (20380024)
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| 研究分担者 |
羽地 達次 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (50156379)
吉田 賀弥 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 講師 (60363157)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 骨 / 骨芽細胞 / 蛋白質脱リン酸化 / PP2A / 転写因子 / Osterix / プロテインホスファターゼ |
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| 研究実績の概要 |
様々な細胞種における現象と同様、骨芽細胞の分化・機能は蛋白質リン酸化酵素 (プロテインキナーゼ) と蛋白質脱リン酸化酵素 (プロテインホスファターゼ) による蛋白質のリン酸化・脱リン酸化により厳密にコントロールされている。PP2Aは真核生物において必須のセリン・スレオニンプロテインホスファターゼであり、細胞分裂、シグナル伝達や代謝などに必要な酵素である。本年度は、in vivoでの骨形成におけるPP2A Cαの役割とPP2A Cαによる骨芽細胞分化の調節機構について調べた。具体的には、マイクロCTを用いたPP2A-Tg (ドミナントネガティブPP2A Cα発現)マウスの骨量・骨密度の解析と摘出した脛骨の切片のHE染色サンプルによる骨形態計測を行った。PP2A Cαが骨芽細胞分化・石灰化をどのような転写調節因子を介して制御するかを解明するため、PP2A Cの発現を抑制した骨芽細胞を用いて、リアルタイムPCR、ウエスタンブロットやルシフェラーゼアッセイにより、転写調節因子の発現と機能を調べた。その結果、1) PP2A-Tgマウスの骨量・骨密度は、コントロールに比べて高く、脛骨の皮質骨厚も増加していた。2) PP2A Cαの発現を抑制した骨芽細胞では、分化・石灰化能が亢進し、骨に必須の転写調節因子Dlx5, Runx2およびOsterixの発現・転写活性が増加していた。3) PP2A Cαの発現を抑制した骨芽細胞でDlx5, Runx2およびOsterixの発現を抑制すると、骨芽細胞分化能が低下した。以上のことから、PP2A CαはDlx5, Runx2およびOsterixの発現を介して骨芽細胞の分化・骨形成を制御する重要な因子と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の本年度実験計画は、1. in vivoでの骨形成におけるPP2A Cαの役割を調べる。2. PP2A Cαによる骨芽細胞分化の調節機構について調べる。ことであった。
PP2A Cαトランスジェニックマウス (PP2A-Tg)雌マウスと野生型のC57BL/6雄マウスと掛け合わせ、4週齢時にジェノタイピングを行った。約半数の割合でPP2A-Tgと同腹仔の野生型のマウスを得た。両群を同一条件下で飼育した後、5週齢から20週齢まで週に一度、麻酔下において体重測定とマイクロCT撮影を行った。得られたデータを統計処理し両群間で比較検討し、画像データを専用ソフトにて３次元構築し、イメージングの解析を行った。PP2A-Tgマウスの骨量・骨密度は、コントロールに比べて高く、脛骨の皮質骨厚も増加していた。また、PP2A Cα発現を抑制した骨芽細胞 (shPP2A-Ob) では、骨分化マーカーの発現を介して骨芽細胞の分化・石灰化が促進されることを見出した。コントロールに比べてshPP2A-Ob細胞では、骨に必須の転写調節因子Osterixの発現が増加していたので、Osterixの上流に位置する転写調節因子Runx2とDlx5の発現をリアルタイムPCRで調べた。それぞれの因子に特異的なsiRNAを導入し、骨分化マーカーの発現を調べる。Osterixプロモーターを含むルシフェラーゼコンストラクトを用いて、Runx2およびDlx5結合部位がOsterix発現に与える影響を調べた。Dlx5, Runx2はOsterixの発現・転写活性を制御しており、PP2A Cαの発現を抑制した骨芽細胞でDlx5, Runx2およびOsterixの発現を抑制すると、骨芽細胞分化能が低下することを見出した。実験は、おおむね計画通り遂行されており、一部の結果を論文投稿した。
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| 今後の研究の推進方策 |
２６年度の研究はおおむね計画通りに進んでおり、当初の実験計画を大きく変更する必要はないと考えている。本年度以降は、脂肪細胞分化におけるPP2A Cαの役割について調べることを中心に研究を行う。PP2A Cα発現が骨芽細胞以外の間葉系細胞種の分化に関与するか調べる。マウス間葉系前駆細胞 (C3H10T1/2) にレンチウイルスベクターを用いてPP2A Cα特異的shRNAを導入し、その発現を恒常的に抑制した細胞株を樹立する。作製した細胞を脂肪細胞の分化誘導培地で培養し、Oil red Oあるいはalcian blue染色を行う。分化誘導した細胞からRNAを抽出し、脂肪分化マーカーの発現を調べる。これらの結果をコントロールの細胞と比較することで、間葉系前駆細胞から脂肪細胞への分化におけるPP2A Cαの役割を調べることができる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初使用を予定していたものより低価格の細胞培養試薬、遺伝子発現解析用試薬を使用することで、研究費を節約し、結果を得ることが出来たため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
翌年度の助成金とあわせ、当初の研究計画より、サンプル数を増やし、より正確なデータを得ることに使用する予定である。
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