| 研究課題/領域番号 |
26462789
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
内藤 真理子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (20244072)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 口腔細菌学 / 歯周病原菌 / 病原因子 / 遺伝子操作 / 鉄獲得 |
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| 研究実績の概要 |
ヘム鉄獲得にはまずヘム蛋白質であるヘモグロビンの分解によるヘム鉄の遊離が必須である。Prevotella intermediaの全遺伝子検索からは蛋白質分解酵素が多数検出された。また本菌が含まれるBacteroides属で見いだされたPor分泌機構すなわちType 9分泌機構（T9SS）がヘム鉄の遊離とその輸送と活性発現に必須であることが示唆されていた。これまでの報告でアミノ酸配列からT9SSにて菌体表面、培養上製へ分泌されることが予測されるタンパク分解酵素とてinterpain A(inpA)がヘム鉄の遊離の遊離にはたらくことが予測されていた。そこで本研究で確立したPre. intermediaにおける遺伝子特異的変異株作成方法を用いてinpA変異株を昨年度の研究で得た。変異株では完全にinpA活性が失われたが、血液寒天上での集落の観察から黒色色素産生性が維持されていることが明らかになった。
そこで本年度の研究ではまずPre. intermediaにおけるT9SSの変異株（porK遺伝子変異株、porT遺伝子変異株）を作成、親株と比較することでT9SSのPre. intermediaにおける役割を検討した。その結果、T9SSはヘム鉄の遊離及び黒色色素産生性に必須であることを明らかにした。そこでまずPre. intermediaにおける全ゲノム配列の決定、さらに本菌のゲノム構造、遺伝子構成の詳細な解析を行った（論文発表及びGenbank登録公開）。得られたゲノム情報からinpAと同じくT9SS分泌シグナル(CTD domain motif)保有する候補蛋白質として選んだ（5遺伝子）。それぞれの遺伝子特異的変異株の作成を試みたところ、4遺伝子の変異株を得ることができた。これらの変異株のうち一つに黒色色素産生性の欠損を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画に沿って、Prevotella intermediaからヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素であるinterpain A遺伝子の変異株の作成に成功したが、当初のもくろみとは違って本菌の黒色色素産生性にはinpA変異だけでは影響がないことを明らかにした。そこで本年度はPrevotella intermediaのゲノム配列の詳細な解析を基に、他のヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素の選出とそれぞれの変異株の作成をめざした。結果候補遺伝子5つのうち、4つの遺伝子の変異株を得ることができた。さらに得られた変異株のうち一つが黒色色素産生性に必須であることを明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Prevotella intermediaの全ゲノム配列解析から得られた全遺伝子のモチーフ検索から選び出したT9SS依存性に分泌されることが予測された5つのタンパク分解酵素遺伝子についての解析を行う。昨年度までは候補遺伝子うち4つの変異株を得ているので、残りの1遺伝子の変異株の作成を行う。
また作成した変異株のうち、黒色色素産生性がみられなくなった遺伝子について詳細な解析を行う。この遺伝子のリコンビナント蛋白質を大腸菌にて発現、精製を行う。得られたリコンビナント蛋白質を用いてヘモグロビン分解活性やヘム鉄結合性をその結合条件（pH,酸化還元状態）を含めて調べる。これまでに本菌自身を用いたヘモグロビン分解活性については幅広いpH条件で活性が存在するが、最も高い活性が認められるのはpH5付近と報告されている(Guan SM et.al. Anaerobe,2006)。そこでリコンビナント蛋白の活性測定には弱酸性である pH5 付近から中性域のバッファーを用いて実験を行う。これにより本菌のヘム鉄獲得に関わる分子を決定する。またこれまでに得られた研究成果をまとめ論文発表を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
繰越金は購入試薬の予定額と確定額の差額が発生した為。
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| 次年度使用額の使用計画 |
嫌気性菌であるPrevotella intermediaとその変異株作成に欠かせない培地類と培養に必須の嫌気培養装置の稼働に必要なガス、キャタリスト、硫化水素吸収剤の購入を予定している。さら成果発表の為に参加する国際学会（国際歯科研究学会：IADR、ソウル、韓国）、国内学会（歯科基礎医学会、札幌）の出張旅費、論文校正、投稿料を 計上する。
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| 備考 |
Prevotella intermediaOMA14の完全長ゲノム配列のDatabaseへの登録及び公開（AccessionNumbers AP014597 and AP014598）
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