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我々は、軟骨分化マスター遺伝子Sox9の機能非依存的に軟骨分化を調節する遺伝子を検索する実験系を確立し、転写調節因子Irx3に着目した。免疫染色の結果、Irx3は胎生13.5日齢マウス軟骨原基の中心部から発現を開始し、その後前肥大層および肥大層に発現を認めた。初期軟骨分化に対するIrx3の作用を調べるために、Limb bud cellおよび未分化線維芽細胞株C3H10T1/2にレトロイウルスを用いてIrx3を過剰発現させると、Irx3はBmp存在下で軟骨細胞分化を促進した。さらに、Sox9をノックダウンしたC3H10T1/2にIrx3を過剰発現させるとSox9機能阻害による軟骨分化低下が有意に回復した。この際、MAPKシグナルを介してepiphycanやlumicanの発現が回復していた。次に後期軟骨細胞分化に対する作用を調べるために、初代ウサギ軟骨細胞にレトロイウルスを用いてIrx3を過剰発現させると、II型コラーゲンやアグリカン発現低下と共に軟骨細胞分化が抑制されたが、Mmp13などの軟骨最終分化関連遺伝子発現は上昇した。この作用は、Irx3がWntシグナルレポーター遺伝子TOPFlash活性を上昇させ、Irx3による軟骨細胞分化の低下がWntシグナル阻害因子dominant-negative LEF1の共発現によって回復されることから、Wntシグナルを介することが判明した。また、Irx3はウサギ軟骨細胞においてWnt共役受容体Lgr6とそのリガンドR-spondin1発現を上昇させ、siLgr6を用いたレポーターアッセイによりIrx3によるWntシグナル伝達の一部はLgr6を介することが示唆された。以上の結果から、Irx3は、Sox9非依存的にMAPKシグナルを介して初期軟骨細胞分化を促進し、Wntシグナル介して後期軟骨細胞分化を調節することが明らかとなった。
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