CCN2による骨細胞機能を標的とした新規骨粗鬆症治療薬の開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26462810
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (30322233)
• 研究分担者: 滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: CCN2/CTGF / 骨細胞 / マウス骨細胞株MLO-Y4 / 破骨細胞形成 / 3次元培養 / 薬剤誘導性Ccn2欠損マウス

研究実績の概要

本研究課題の目的は骨リモデリングの司令塔的役割を担う骨細胞に対するCCN family protein 2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)の役割を骨細胞による破骨細胞形成への影響の観点から解析し、新規骨粗鬆症治療薬としての可能性を検討することである。平成26年度は主にマウス骨細胞様細胞株であるMLO-Y4細胞を用いてin vitroにおけるCCN2の作用を明らかにした。(1)単層培養したMLO-Y4細胞は星状の形態を示したが、生体で見られる様な長い突起形成は見られなかった。そこで、コラーゲンゲル内で3次元培養したところ、細胞間に長い突起形成が見られ、より生体内に近い形態を示した。よって、CCN2の機能解析はMLO-Y4細胞を主に3次元で培養して行った。(2) 組換えCCN2タンパク質(rCCN2)でMLO-Y4細胞を刺激すると、Ccn2の遺伝子発現レベルと骨細胞マーカーの一つであるSostの遺伝子発現レベルが上昇した。(3) MLO-Y4細胞に超音波刺激を加えると、Ccn2及びSost遺伝子の発現レベルの上昇が見られた。(4) 3次元培養したMLO-Y4細胞上にマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を播種し、GST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導すると、rCCN2を添加したMLO-Y4細胞培養系で破骨細胞形成に必須な転写因子であるNFATc1の産生量の増加が見られた。(5) CCN2の老齢期マウスの骨細胞への影響を解析するために、京都大学から供与されたCCN2flox/floxマウスとJackson labから購入したCAG-CreER transgenicマウスを交配し、タモキシフェンによって誘導できるCcn2欠損マウスを作製した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成26年度の研究目的は本課題に適したMLO-Y4細胞の培養条件の検討とその培養条件によるCCN2の作用を明らかにすることであるため、MLO-Y4細胞の3次元培養の確立とCCN2刺激されたMLO-Y4細胞によるRAW264.7細胞の破骨細胞形成に対する促進作用を明らかにしたことにより、概ね順調に進展していると考えられる。また、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの作製に成功しており、この点からも本課題は順調に進展している。しかしながら、平成27年度に予定している実験を遂行するためには上記マウスの匹数が十分ではないので、まず、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの匹数を増やす必要がある。

今後の研究の推進方策

平成27年度から昨年度作製した薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを長期飼育し始める。平成27年度では、この内の3ヶ月齢のマウスを使って、生後3ヶ月後にタモキシフェンをマウスに投与する。タモキシフェン投与によってCCN2が欠失するので、マウスを安楽死後、大腿骨及び脛骨を採取し、骨組織中の骨量や骨密度がどのような影響を受けているかをマイクロCTや組織化学的手法により検討する。また、タモキシフェンを投与した薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの大腿骨から骨細胞を単離し、3次元培養する。3次元培養上に同じマウスから採取した骨髄細胞を播種し、破骨細胞に誘導させた時に破骨細胞形成がどのような影響を受けるのかを検討する。平成27年度以降、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスは老齢期まで飼育を継続し、平成28年度以降の解析に備える。

次年度使用額が生じた理由

当初予定として平成27年度から薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを用いたin vivo解析を始める予定であったが、平成26年度は薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの作製までであり、in vivo実験を遂行するだけの匹数の確保までは進展できなかった。そのため、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの繁殖と維持に使用予定であった金額が余剰した。

次年度使用額の使用計画

平成27年度は早急に薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの繁殖を行い、実験条件にあったマウスを確保し、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを用いたin vivo解析を開始する予定であり、平成27年度に請求する研究費と当該研究費を合わせて研究計画を実施する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] CCN2 enhances RANKL-induced osteoclast differentiation via direct binding to RANK and OPG. (2015)
  • 著者名/発表者名: Aoyama, E., Kubota, S., Khattab, H. M., Nishida, T., Takigawa, M.
  • 雑誌名: Bone 巻: 73 ページ: 242-248
  • DOI: 10.1016/j.bone.2014.12.058. Epub 2014 Dec 30.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] CCN family protein 2 (CCN2) promotes the early differentiation, but inhibits the terminal differentiation of skeletal myoblasts. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E.,Janune, D., Lyons, K.M., Takigawa, M.
  • 雑誌名: J Biochem. 巻: 157 ページ: 91-100
  • DOI: 10.1093/jb/mvu056. Epub 2014 Sep 26.
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Direct interaction between CCN family protein 2 and fibroblast growth factor 1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kader, T., Kubota, S., Anno, K., Tanaka, S., Nishida, T., Furumatsu, T., Aoyama, E., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 雑誌名: J. Cell Commun. Signal. 巻: 8 ページ: 157-163
  • DOI: 10.1007/s12079-014-0232-z. Epub 2014 Jun 6.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Differential expression of vascular endothelial growth factor in high- and low- metastasis cell lines of salivary gland adenoid cystic carcinoma. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kondo, S., Mukudai, Y., Soga, D., Nishida, T., Takigawa, M., Shirota, T.
  • 雑誌名: Anticancer Res. 巻: 34 ページ: 671-677
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] CCN2 as a novel molecule supporting energy metabolism of chondrocytes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maeda-Uematsu, A., Kubota, S., Kawaki, H., Kawata, K., Miyake, Y., Hattori, T., Nishida, T., Moritani, N., Lyons, K. M., Iida, S. and Takigawa, M.
  • 雑誌名: J. Cell Biochem. 巻: 115 ページ: 854-865
  • DOI: 10.1002/jcb.24728.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The regenerative effects of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarthritis models in vivo. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kader, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 雑誌名: Bone 巻: 59 ページ: 180-188
  • DOI: 10.1016/j.bone.2013.11.010. Epub 2013 Nov 20.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] E6-AP/UBE3A Protein, a Ubiquitin Ligase toward SOX9 Protein is essential to endochondral ossification. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hattori, T., Kishino, T., Stephen, S.,Eberspaecher, H., Maki, S., Takigawa, M., Nishida, T., Kubota, S., de Crombrugghe, B., Yasuda, H.
  • 学会等名: Gordon Research Conference, Cartilage Biology &Pathology
  • 発表場所: Galveston, TX, USA
  • 年月日: 2015-03-22 – 2015-03-27
• [学会発表] CCN2とRab14の相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割。 (2015)
  • 著者名/発表者名: 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、上岡 寛、滝川正春
  • 学会等名: 第28回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-03-06 – 2015-03-07
• [学会発表] 軟骨細胞分化に与えるセロトニンの作用。 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、滝川正春
  • 学会等名: 第28回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-03-06 – 2015-03-07
• [学会発表] SOX9のユビキチンリガーゼE6-AP/UBE3Aは正常な骨格形成に必須である。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 服部高子、木住野達也、Shelley Stephen、Heidi Eberspaecher、巻さゆみ、滝川正春、西田 崇、久保田聡、Benoit de Crombrugghe、安田秀世
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] Assessment of the regenerative effects of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarturiritis models in vivo. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] CCN2は筋芽細胞の初期分化を促進するが、後期分化を抑制する。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、ダニーロ ジャヌネ、カレン ライアン、滝川正春
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] トランスオーミックアプローチによるCCN2の代謝支持機能の解明。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 久保田聡、村瀬友里香、植松-前田 彩、服部高子、西田 崇、滝川正春
  • 学会等名: 第6回CCNファミリー研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-08-30 – 2014-08-30
• [学会発表] 高分化型および低分化型ヒト口腔癌細胞株におけるCCNファミリータンパク質の発現。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高嶋荘一朗、西田 崇、久保田聡、滝川正春
  • 学会等名: 第6回CCNファミリー研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-08-30 – 2014-08-30
• [学会発表] CCN2に依存した低出力超音波(LIPUS)の軟骨細胞への作用メカニズムの解明。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、Lyons, K. M., 滝川正春
  • 学会等名: 第6回CCNファミリー研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-08-30 – 2014-08-30
• [学会発表] RANKデコイレセプターOPGとCCN2の相互作用。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 青山絵理子、西田 崇、久保田聡、滝川正春
  • 学会等名: 第6回CCNファミリー研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-08-30 – 2014-08-30
• [学会発表] The regenerative effect of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarturiritis models in vivo. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E.,Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 第6回CCNファミリー研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-08-30 – 2014-08-30
• [学会発表] 軟骨分化促進因子CCN2の新たな細胞内機能：CCN2とRab14GTPaseの相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、上岡 寛、滝川正春
  • 学会等名: 第32回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-07-24 – 2014-07-26
• [学会発表] 培養軟骨細胞における低出力性超音波(LIPUS)によるCCN2産生亢進機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、Lyons, K. M., 滝川正春
  • 学会等名: 第32回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-07-24 – 2014-07-26
• [学会発表] LIPUS promotes CCN2-mediated cartilage matrix gene expression via MAPK pathways. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Yamanaka, N., Takigawa, M.
  • 学会等名: 92nd IADR
  • 発表場所: Cape Town, South Africa
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-28
• [学会発表] CCN2 induces osteoclastogenesis by regulating RANK/RANKL/OPG system. (2014)
  • 著者名/発表者名: Aoyama E, Kubota S, Nishida T, Takigawa M
  • 学会等名: ECTS Congress 2014
  • 発表場所: Prague, Czech Republic
  • 年月日: 2014-05-17 – 2014-05-20
• [備考] 岡山大学歯学部口腔生化学分野
  • URL: www.okayama-u.ac.jp/user/seika/index.html