| 研究課題/領域番号 |
26462825
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
島田 明美 鶴見大学, 歯学部, 学内講師 (00339813)
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| 研究分担者 |
二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
和田 悟史 鶴見大学, 歯学部, 助教 (20581119)
山下 照仁 松本歯科大学, 付置研究所, 准教授 (90302893)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | アネキシンA5 / 腱 / 骨 |
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| 研究実績の概要 |
骨と靭帯・腱との接合部(enthesis)における機械的刺激による骨形成や骨リモデリングの分子メカニズムについては不明な点が多い。Anxa5はメカニカルセンサー、アポトーシスシグナル伝達、細胞膜裏打ちタンパクとしての膜修復調節など多彩な機能が見出されている。我々の予備検討によりAnxa5遺伝子の下流にlacZを挿入したAnxa5機能欠損マウス(Anxa5-/-)においてenthesis周囲で特異的に骨が肥大していることを見出した。このことから、enthesisのリモデリングが腱・靭帯組織と骨組織のAnxa5を介した相互作用により調節されているという仮説を立てた。
まず、成体マウスにおけるAnxa5の発現部位をlacZの組織染色で調べたところ、関節軟骨、骨膜、および骨と腱・靭帯付着部に特異的に発現していた。次にAnxa5欠損によりenthesisで生じる骨形態の変化をマイクロCTにより解析した。生後４週において、Anxa5-/-と野生型の間に骨の顕著な差は認められなかったが、生後７週以降のAnxa5-/-マウスにおいて、骨と腱・靭帯付着部において野生型に比べて特異的な肥大化を認めた。骨幹部における皮質骨断面積や骨密度には顕著な差は認められなかった。この表現型は脛骨、大腿骨、上腕骨、下顎骨など、調べた骨でいずれも共通していた。生後12週に前脛骨筋に付着する腱を切断し、運動機能を制限したところ、Anxa5-lacZマウスおよび野生型マウスのいずれにおいても、術後８週の腱付着部における脛骨皮質骨の縮小が認められた。これらの結果は、Anxa5が骨と腱・靭帯の付着部において、機械的刺激依存的なenthesis領域の骨形成に関与することを示唆するものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、Anxa5－/－および野生型マウスの頭蓋骨より骨芽細胞を分離培養し、各々の細胞増殖能や遺伝子発現解析を行う計画であったが、成体マウス頭蓋骨から分離した骨芽細胞の分離が安定せず、検討に時間を要した。現在は、MC3T3-E1などの骨芽細胞系cellにsiRNAによるAnxa5ノックダウンを行い、その影響を検討している。腱細胞については、培養条件が確立しており、Anxa5－/－および野生型の成体マウスから安定して腱細胞が得られている。これらの細胞を用いて引き続きEnthesisにおける骨隆起は腱細胞と骨芽細胞のいずれに起因するのか、共培養による解析を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
骨芽細胞系cell lineに対し、siRNA添加によりAnxa5をノックダウンする。また、Anxa5－/－および野生型マウスから各々分離した腱細胞を得る。これらの細胞を共培養し、MTT法により細胞増殖を、TUNEL法により細胞の生存を、分化マーカーのリアルタイムPCR解析あるいは免疫組織化学により各々の細胞分化への影響を評価する。野生型細胞同士の組み合わせと比較して、影響の現れる細胞の組み合わせから、Anxa5-/-における表現型が主に腱細胞に起因するのか、あるいは骨芽細胞に起因するのかを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Anxa5-/-マウス由来初代培養骨芽細胞の安定的な培養条件の検討に時間を要し、比較的高額な分子生物学的解析に用いる試薬の利用が少なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Cell lineを用いた安定的な培養系を用いた解析が順調に推移しており、この研究のために使用する。
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