| 研究課題/領域番号 |
26462828
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
鈴木 崇弘 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (70298545)
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| 研究分担者 |
水野 光政 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (20609812)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生物発光 / イメージング / 骨芽細胞 / 骨形成因子 / ルシフェラーゼ / エキソサイトーシス / 分泌 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質分泌の生物発光イメージング法は、細胞外へ分泌されたタンパク質を特異的に光らせ、開口分泌により細胞外へ拡散していくタンパク質動態を全細胞表面において可視化できる利点がある。その一方で、微弱な発光を検出することから、分泌タンパク質の効率的な発現により発光量を増大させることが望まれる。昨年度の成果として、ヒトで最も使用頻度の高いコドンのみで最適化する方法（preferred human codon optimized method, “Preferred法”）により、各種ルシフェラーゼを高発現できることを示した。これを受けて本年度は、シンプルなコドン最適化法であるPreferred法により哺乳類細胞での遺伝子発現に最適化したガウシアルシフェラーゼ（Gaussia lucifease, GLase）遺伝子であるpGLucを用いることで、骨芽細胞株では通常のコドン最適化法でデザインされた遺伝子（hGLuc）よりも高いGLase発現効率を示すことを明らかにした。特に、各種培養細胞と比較して骨芽細胞は、GLaseについてPreferred法によるコドン最適化した遺伝子を用いることでより高い発現効率が得られることが示唆された。さらに、BMP-2についてPreferred 法で作製した遺伝子を用いることで、GLase融合タンパク質の発現効率を高め、生物発光イメージング像を改善することができた。また、オステオカルシンGLase融合タンパク質を定常的に発現する細胞株を樹立した。生物発光・蛍光イメージングによる解析法の開発については、実験系の改良を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
各種培養細胞に加えて、骨芽細胞においても、"preferred human codon-optimized method"によってコドン最適化を行ったpGLucが、一般的に用いられているコドン最適化GLase遺伝子よりも高い発現を示すことを明らかにし、学会発表を行った。
オステオカルシン、BMP-2について、定常発現細胞株の樹立、コドン最適化による発現効率の向上など、順調に研究を進めることができた。また、生物発光・蛍光によるデュアルモードイメージング法についても、順調に解析系の至適化を進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
BMP-2以外の骨形成関連遺伝子についても"preferred human codon-optimized method"によってコドン最適化したGLase融合遺伝子を用いることにより、より発現量を高めることを行いながら、オステオカルシン、BMP-2、コラーゲンの骨芽細胞からのタンパク質分泌極性を明らかにする。また、発光蛍光のデュアルモードイメージング法を確立し、本法を駆使することで、顆粒動態と極性分泌動態の関係性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度、細胞培養関連の支出が抑制されたことから、本年度、比較的に高額な細胞培養実験試薬を用いた実験を行う計画としていたが、当初からの予定していた定常発現株の作製、発光蛍光イメージング法の開発に加え、当初からの計画からは予想外に発展させることができたコドン最適化遺伝子発現法の応用実験に注力したことから、高額となる細胞培養関連の支出が抑制された。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細胞シート培養、3D培養、特殊コーティングのガラスボトムディッシュなど、比較的高額な細胞培養実験に使用することで、解析内容を充実させる。また、コドン最適化法により各種ルシフェラーゼ・発光タンパク質を解析に生かせることができる見込みとなったことから、生物発光関連遺伝子・抗体・発光基質を充実させる。
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