| 研究実績の概要 |
本研究は、口腔細菌の腸管への影響を自然免疫の観点から検討するために、腸管自然免疫の主要エフェクターである抗菌ペプチド・α-defensinを分泌し自然免疫や腸内細菌叢の恒常性維持に寄与するPaneth細胞に焦点をあてた新規腸管自然免疫評価系を、オルガノイド培養法を応用して開発することを目的とした。平成27年度は、オルガノイドを構成する、Paneth細胞のCCh、LPS刺激によりるα-defensin分泌応答をELISAにて検討した。Paneth細胞基底膜側の刺激物と考えられるCCh処理で、培養上清中α-defensin濃度はCCh濃度依存的に上昇した。一方、 内腔側からの刺激物と考えられるLPS処理では、α-defensin濃度は上昇しなかった。以上の結果より、Paneth細胞は基底膜側からの刺激物に応答する一方, 内腔側からの刺激物にはオルガノイドが閉鎖構造のため刺激物が到達できず、応答できないことが考えられた。そこで、オルガノイド内腔に目的の刺激物質を到達させるために、刺激物質を添加するタイミングを、小腸陰窩内腔が閉鎖する前の、マトリゲルに包埋直後に行うことを考えた。 目的の刺激物が陰窩内腔に到達しているのかを確認するために、蛍光物質をマトリゲルに添加し、蛍光顕微鏡で観察したところ、内腔に培地およびマトリゲルが進入しており、約30分～70分で内腔が閉鎖した。次に、100 μM CChおよび100 μg/ml LPSをマトリゲルに添加し、培養上清のα-defensin濃度を測定したところ、それぞれ未処理と比べて有意に上昇した。本研究により、オルガノイドとELISAを用いたPaneth細胞・α-defensinを指標とした新規腸管自然免疫評価系を確立できた。この評価法を応用することで、口腔細菌と腸管自然免疫の相互作用解析が可能となる。
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