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2014 年度 実施状況報告書

KLF依存性細胞分化‐EMT誘導因子の同定と口腔癌進行抑制効果の解析

研究課題

研究課題/領域番号 26462859
研究機関日本歯科大学

研究代表者

今井 一志  日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10328859)

研究分担者 須藤 遙  日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (20372980)
千葉 忠成  日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (60350138)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2018-03-31
キーワードKLF / 口腔癌 / 転写因子 / プロモーター / Sp1
研究実績の概要

KLF5は口腔癌細胞の分化を抑制する転写因子であり、KLF5発現の異常が口腔癌の進展に大きな役割を果たす可能性を明らかにした。そこで、ヒトKLF5遺伝子のプロモーター領域とエクソン1の一部を含むDNAフラグメント(-2,001~+424 bp)をBACクローンから単離し、様々長さをもつ10種類の断片をPCRで増幅し、ルシフェラーゼアッセイ用レポータープラスミドにクローニングした。断片のDNA配列に変異がないことを確認後、293T細胞とHSC2口腔癌細胞にプラスミドを導入し、24 h後のルシフェラーゼ活性を測定するデュアルレポーターアッセイを行った。その結果、KLF5発現に不可欠な必要最小領域は+145~+331 bpの187 bpに限定された。転写因子結合配列をデータベース検索したところ、この領域には6か所のGCボックス(Sp1結合配列)と1か所のCACCC配列(KLF結合配列)が存在した。KLF4あるいはKLF5のcDNAとレポータープラスミドを同時に導入してもルシフェラーゼ活性には変化が見られなかったことから、Sp1の関与が疑われた。そこで、GCボックスのそれぞれに変異をもつミュータントプラスミド(mGC1~mGC6)を作製しレポーターアッセイを行った結果、+129~+142(mGC1)あるいは+299~+312(mGC6)がKLF5発現を大きく低下させ、特にmGC1ではルシフェラーゼ活性が80.5%減少した。従って、ヒトKLF5遺伝子の発現はSp1による制御が重要と考えられる。今後、クロマチン免疫沈降実験等を行い、多角的にその重要性を検証する予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度(平成26年度)に設定した計画はKLF遺伝子のプロモーター解析であり、その目的はほぼ達成された。

今後の研究の推進方策

クロマチン免疫沈降法等による解析を追加した後、速やかに学術雑誌に投稿する予定でいる。2年目(平成27年度)以降は、KLFにより細胞外に分泌される液性因子を単離精製・同定し、口腔癌細胞の表現型(特に分化形質)に与える作用を明らかにする。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] Kruppel-like factors 4 and 5 expression and their involvement in differentiation of oral carcinomas.2015

    • 著者名/発表者名
      Shibata M, Chiba T, Matsuoka T, Mihara N, Kawashiri S, Imai K.
    • 雑誌名

      Int J Clin Exp Pathol

      巻: 8 ページ: 未定

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Promoter analysis of Kruppel-like factor 5 gene.2015

    • 著者名/発表者名
      Mihara N, Chiba T, Sudo H, Imai K
    • 学会等名
      General Session and Exhibition of the IADR
    • 発表場所
      ボストン(米国)
    • 年月日
      2015-03-11 – 2015-03-14
  • [学会発表] Kruppel-like factor 5遺伝子のプロモーター解析2014

    • 著者名/発表者名
      美原希美、千葉忠成、須藤遥、今井一志
    • 学会等名
      歯科基礎医学会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2014-09-25
  • [学会発表] 口腔癌におけるKLF4/5の発現と上皮ー間葉移行への関与2014

    • 著者名/発表者名
      柴田征紀、川尻秀一、今井一志
    • 学会等名
      日本口腔科学会
    • 発表場所
      京王プラザホテル(東京都新宿区)
    • 年月日
      2014-05-08

URL: 

公開日: 2016-05-27  

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