| 研究課題/領域番号 |
26462985
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
石坂 亮 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (00705197)
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| 研究分担者 |
中島 美砂子 独立行政法人国立長寿医療研究センター, 歯科口腔先進医療開発センター 再生歯科医療研究部, 部長 (20207773)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯髄再生 / 幹細胞 / 培養上清 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、培養上清による歯髄再生を目指して、再生に必要なタンパクを同定し、そのタンパクによる再生治療の可能性を検索することを目的とする。本年度は歯髄・骨髄・脂肪幹細胞培養上清を分離し、培養上清のtrophic効果の検討を行った。
まず、ブタ歯髄・骨髄・脂肪組織から酵素消化により細胞を分離し、フローサイトメーターを用いて幹細胞を分取後、細胞の形質を維持したまま60～70%コンフルエントまで培養した。その後、無血清下にて24時間培養し、幹細胞培養上清を回収した。さらに、回収した各培養上清を3,000Kのフィルターにて遠心濃縮し、5ug/mlに調整した。
次に、各培養上清をマウス筋芽細胞に添加し、増殖促進能（Tetra Color ONEを添加し吸光度450nmにて測定）・遊走促進能（TAXIScan-FLにて解析）・血管新生能（VE-cadherinにて免疫染色後、蛍光顕微鏡にて観察）・神経伸長促進能（神経芽腫細胞に各培養上清を添加し神経突起の伸長を比較）を比較検討したところ、増殖促進能に差は認められなかったが、遊走促進能・血管新生能・神経伸促進能はいずれも歯髄・骨髄・脂肪の順に高い結果となった。また、抗アポトーシス能をフローサイトメトリーにて、抗炎症作用をMLR(Mixed lymphocyte reaction)にて解析したところ、いずれも歯髄・骨髄・脂肪の順に高い結果となった。
これらの結果より各培養上清は再生に関与するtrophic効果を有し、さらには、歯髄が最も高いtrophic効果を有していることを明らかとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はin vitroにおいて歯髄・骨髄・脂肪幹細胞培養上清の再生に関与するtrophic効果を比較検討した。ブタ歯髄・骨髄・脂肪組織から幹細胞を分取し、増殖促進能・遊走促進能・血管新生能・神経伸長促進能・抗アポトーシス能・抗炎症作用を比較したところ、増殖促進能に差は認められないが、遊走促進能・血管新生能・神経伸長促進能・抗アポトーシス能・抗炎症作用は歯髄・骨髄・脂肪幹細胞培養上清の順に高く、歯髄幹細胞上清が最も高いtrophic効果を有していることを明らかとした。
また、各培養上清の異所性歯根移植に向けて最適条件を模索し、幹細胞培養上清のみの移植において歯髄様組織が再生することを明らかとした。
培養上清のtrophic効果の検討および培養上清を用いた異所性歯根移植が成功している点から、その後の実験はほぼ滞りなく進めることができると考え、上記の自己点検による評価を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は、ブタ歯根内にコラーゲンとともに歯髄・骨髄・脂肪培養上清を注入してSCIDマウスに異所性に移植し、trophic因子の集積物である上清のみの移植によって歯髄組織が再生されることを示し、幹細胞そのものではなく周囲からの遊走細胞が微小環境を得て組織を再生させることを明らかにする。また、各培養上清移植により再生した組織の再生量・質を比較し、三者間で差があるか検討する。
平成28年度は、培養上清をイオン交換クロマトグラフィーによりフラクションにわけ、それぞれの遊走促進能を比較する。そこで高い遊走促進能を示したフラクションを異所性歯根移植に用いて、遊走因子を多く含むフラクションを特定する。そのフラクションを質量解析し、さらにリコビナンドタンパクを作成し、in vitroでの添加実験および異所性移植を行うことで細胞遊走因子を同定する。
以上の事から、同定した細胞遊走因子が組織再生を担うことを証明し、細胞を必要としない新たな再生治療の可能性を示す予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度はin vitroの実験を中心に行っており、試薬等は研究室に在庫があったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度はin vivoの実験を中心に行うため、SCIDマウス購入および再生組織の染色に必要な抗体の購入を予定している。
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