| 研究課題/領域番号 |
26462999
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
佐野 和生 福井大学, 医学部, 教授 (20145270)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 扁平上皮癌 / 血管新生阻害剤 / 腫瘍制御 / 局所注入療法 |
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| 研究実績の概要 |
高齢者の異時性口腔癌制御を目的として、血管新生阻害剤を用いた局所注入療法についてヌードマウス口腔扁平上皮癌背部皮下移植モデルを用いた実験的検討を行った。平成26年度には、まず、九州大学口腔病理学教室より供与を受けた口腔扁平上皮癌細胞株の細胞培養、細胞の分子生物学的特徴の解析を行った。ベバシズマブはVEGF-Aに結合して血管新生を抑制するため、ヌードマウスに口腔扁平上皮癌細胞株を移植前に、移植する口腔扁平上皮癌細胞株にVEGF-Aが発現しているか、mRNAレベルで口腔扁平上皮癌細胞株におけるVEGF-Aの発現量をreal-time PCRにより解析した。ヒト角化細胞HakaTをコントロールとして使用し、口腔扁平上皮癌細胞株として、HSC-2,HSC-3, HSC-4, MISK81-5, SASを用いた。すべての細胞でVEGF-A の発現が確認できた。その中でも、HSC-3においてVEGF-Aの発現量が最も高かった。そこで、HSC-3をヌードマウスに移植し、ベバシズマブ投与前の予備実験を開始した。ヌードマウス癌背部移植モデルを作成し、HE染色による組織学的評価、Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の増殖率の検討を行ったところ、腫瘍細胞の密度が予期したものより低いため、以降、細胞密度を高める目的で詳細な検討を行う必要性が生じた。一方、腫瘍周囲への局所注入療法薬の分布を調べるため、インジゴカルミンを腫瘍周囲に局所注入した。その結果、腫瘍基部が特に青染したため、局所注入療法が有効であることが示唆された。
今後、細胞密度の高い癌背部皮下移植モデルを確立後、血管新生阻害剤局所注入療法を行い、腫瘍制御効果の組織学的検討を行うこととした。さらに、舌への癌移植モデルにおいても検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ベバシズマブはVEGF-Aに結合して血管新生を抑制するため、ヌードマウスへの腫瘍移植前に、移植する口腔扁平上皮癌細胞株にVEGF-Aが発現しているか、mRNAレベルで口腔扁平上皮癌細胞株におけるVEGF-A発現量の解析を行った。ヒト角化細胞HakaTをコントロールとして使用し、口腔扁平上皮癌細胞株として、HSC-2,HSC-3, HSC-4, MISK81-5, SASを用いた。すべての細胞でVEGF-A の発現が確認できた。その中でも、HSC-3においてVEGF-Aの発現量が最も高かった。そこで、HSC-3をヌードマウスに移植することとした。
平成26年度にはヌードマウス口腔扁平上皮癌背部皮下移植モデルを用いて、抗腫瘍効果を有し、正常組織への副作用が少ないベバシズマブの至適濃度を決定したうえで、ベバシズマブの局所注入療法を行い、腫瘍体積測定、画像解析による腫瘍壊死面積測定、増殖細胞、微小血管やアポトーシスのマーカーを用いた免疫組織化学的検索を行い、その有効性を組織学的に明らかにする予定であった。HSC-3によりヌードマウス口腔扁平上皮癌背部移植モデルを作成し、組織学的評価を行ったところ、腫瘍細胞の密度が予期したものより低いため、以降、細胞密度を高める目的で詳細な検討を行う必要性が生じた。細胞密度の高い癌背部皮下移植モデルを確立後、血管新生阻害剤局所注入療法を行い、腫瘍制御効果の組織学的検討を行うこととした。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．ヌードマウス口腔扁平上皮癌背部皮下移植モデルにおける血管新生阻害剤局所注入療法による腫瘍制御効果の組織学的・免疫組織化学的解析
１）局所注入療法に適したベバシズマブ至適濃度の決定として、口腔扁平上皮癌細胞をヌードマウス背部皮下に移植し、以下の３群を設定する。A群：対照群（１）：無治療 B群：対照群（２）：腫瘍周囲に生理食塩水を注入 C群：実験群：腫瘍周囲に段階別濃度の血管新生阻害剤（ベバシズマブ）を注入。局所注入療法後、経時的に腫瘍体積測定、組織学的検討を行い、至適濃度を決定する。
２）ベバシズマブ局所注入療法による腫瘍制御効果の検討として、① 腫瘍体積の測定
② パラフィン連続切片を作製し、以下の検討を行う。③ HE染色による組織学的検討 ④ Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の増殖率の検討 ⑤ TUNNEL法によるアポトーシスの検討 ⑥ CD31免疫染色による微小血管密度の測定 ⑦ α-SMA免疫染色による検討 ⑧ 画像解析装置による腫瘍壊死面積の測定。対照群、実験群における腫瘍の増殖能、アポトーシスについて検討する。また、CD31免疫染色の結果をもとに微小血管密度に関する画像解析を行う。CD31とα-SMA免疫染色の結果をもとに血管成熟指数を算定する。腫瘍壊死面積については画像解析装置を用いて数値化を図る。
２．ヌードマウス口腔扁平上皮癌舌移植モデルにおける血管新生阻害剤局所注入療法による腫瘍制御効果の組織学的・免疫組織化学的解析を行う。１，２の結果をもとに血管新生阻害剤局所注入療法の有効性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ヌードマウス癌背部移植モデルを作成し、HE染色による組織学的評価、Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の増殖率の検討を行ったところ、腫瘍細胞の密度が予期したものより低いため、以降、細胞密度を高める目的で詳細な検討を行う必要性が生じた。このため、平成26年度には血管新生阻害剤（アバスチン）、免疫染色試薬（CD31,α-SMAに対する抗体）
、アポトーシス検討のためのTUNNEL法試薬などの購入を行わず、購入を次年度へ繰り越すこととした。平成27年度に細胞密度の高い癌背部皮下移植モデルを確立後、血管新生阻害剤局所注入療法を行い、腫瘍制御効果の組織学的検討を行うこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度には、腫瘍密度を高めたヌードマウス口腔扁平上皮癌背部皮下移植モデルおよびヌードマウス口腔扁平上皮癌舌移植モデルを用いて血管新生阻害剤局所注入療法による腫瘍制御効果の組織学的・免疫組織化学的解析を行う。このため、細胞培養試薬、ヌードマウス、組織切片作製用試薬・材料、免疫染色関連試薬、アポトーシス関連試薬の購入が必要となる。
具体的には、①腫瘍体積の測定、② パラフィン切片の作製、③ HE染色による組織学的検討、④ Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の増殖率の検討、⑤ TUNNEL法によるアポトーシスの検討、⑥ CD31免疫染色による微小血管密度の測定、⑦ α-SMA免疫染色による検討、⑧ 画像解析装置による腫瘍壊死面積の測定を行い、対照群、実験群における腫瘍の増殖能、アポトーシスについて検討する。これらの結果をもとに血管新生阻害剤局所注入療法の有効性を明らかにする。
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