| 研究課題/領域番号 |
26463058
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
脇田 亮 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (60376712)
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| 研究分担者 |
船山 ひろみ 鶴見大学, 歯学部, 助教 (00359530)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 気管支平滑筋 / 漢方薬 / Caチャンネル |
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| 研究実績の概要 |
漢方配合剤ASHMIに含まれるTrifolirhizinには近年抗アレルギー作用の存在が示唆されており、PKA活性化による筋弛緩を示唆する結果を得ている。しかし一方で漢方成分の作用には不明な点も多く、我々は一部の成分が気管上皮へ作用しその結果産生されたPGE2等のケミカルメディエータが気管支を二次的に弛緩させるという、気管クロストーク仮説を考えた。
漢方成分の一つであるTrifolirhizinのPLCbを介するmyosin light chainのリン酸化経路への影響を確認し、50uM以上で明らかにPLCb活性を抑制することが示された。一方気管支平滑筋のprimary cell培養細胞を用いた生薬由来成分の平滑筋収縮・弛緩に及ぼす影響に関しては、現在測定条件の評価中である。筋収縮発現に影響する細胞内カルシウム濃度;｛Ca2+｝i変化をASHMIやTrifolirhizin等の漢方成分存在下に安定して検出するためにはCalcium assay kitを含む新規蛍光プローブが必要となる。プローブの選定は完了したが、その後測定機器と細胞保管設備に不具合が発生したため、研究の一時中断を余儀なくされた。しかし既存の細胞株およびGABA受容体抑制物質を用いた｛Ca2+｝iの変動は別施設ですでにその測定方法も確立しており、今後はPGE2前処理と漢方成分前処理による｛Ca2+｝i変化への影響を確認後、細胞内反応伝達の違いに関して。また直接EP2/4受容体による筋弛緩経路を介することの検索のため、ヒスタミン刺激による気管支平滑筋刺激による反応経路検索を目的にwestern blotを用いてそれぞれ検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
漢方薬の色調と干渉しない蛍光プローブの検索中に、27年度から使用予定の共用施設の測定装置不備が原因となった不具合が発生し、細胞内カルシウム濃度測定条件の設定が予定通り進行しなかった。また年度後半には細胞を保管している冷凍庫の故障により、保管していた気管支平滑筋細胞の保存株が使用不能になり、新規継代を作成しなければならなくなった。これらの設備に起因する問題は年度末には解決しており、再度のプローブ選定の結果、既に新しいプローブを選択済である。以降はは従来通り細胞内カルシウム濃度の測定が可能となり、現在の遅延は回復できると考えている。また研究分担者によるwestern blottingでは、ヒスタミン刺激によるphospho CREBの増加を確認することが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
気管支平滑筋培養細胞のprimary cell lineと同様の方法で気管支上皮培養細胞においても漢方成分のPGE2産生に対する影響を検討する。細胞株は必要に応じてEP1/2/4受容体遺伝子導入を行う。種々の漢方成分単体あるいは合剤によるmyosin light chainのリン酸化に関し検討する。特に各成分の相加作用に注目し、気管支平滑筋培養細胞を用いた複数の漢方成分による[Ca2+]i変化をCa2+蛍光プローブで測定する。各成分投与による気管支上皮培養細胞上清中のPGE2濃度もEIAキットを用い評価する。更に培養細胞を用いた結果を検証するため、wild typeマウス摘出気管支を用いてin vivoにおけるアセチルコリン刺激による気管支収縮における漢方成分の抑制効果や前処理による予防効果を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
気管支平滑筋培養細胞を用いた、筋収縮発現の指標としてのヒスタミン刺激に対する細胞内カルシウム濃度変化を検出するためのCa2+蛍光プローブの検討中に、測定機材であるマイクロプレートリーダーおよび培養細胞保管用冷凍庫の不具合により、研究の進行速度が現弱した。そのためにプローブの選定は完了したものの、次いで行う各種刺激・阻害薬および、遺伝子導入等が行われなかったために費用が生じなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
気管支平滑筋培養細胞や気管上皮培養細胞を用いて、筋収縮発現に必る要なCa2+i変化をCa2+プローブを用いマイクロプレートリーダーを用い測定する。またphospho-CREB, phosphor myosin light chainを標的としたwestern blottingを行い、実際の筋収縮の活性化を検証する。各成分による筋収縮抑制性ケミカルメディエータ産生量をEIA kit等を用い評価する。これらを各成分単体だけでなく併用による効果に関しても同様に検証する。可能であればwild typeマウス摘出気管支を用いてin vivoにおけるアセチルコリン刺激に対する収縮抑制効果を比較検討する。
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