| 研究課題/領域番号 |
26463076
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
三上 俊成 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (40405783)
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| 研究分担者 |
熊谷 章子 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (10286594)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 顎関節症 / 病理検査 / 液状検体 / 遺伝子検索 |
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| 研究実績の概要 |
26年度終了時までに、顎関節症患者の顎関節洗浄液中に含まれる細胞成分からのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックを作製し、組織標本を用いた形態解析を行ってきた。洗浄液中の炎症性サイトカイン(IL-6など)のタンパク分析もELISA法で試みたが、検体の粘性により成功率が低かった。そこで代わりに、FFPEブロックからtotal RNAを抽出して次世代シーケンスでトランスクリプトーム解析を行い、網羅的遺伝子発現解析を行うための解析フローを確立した。26年度の結果からは、(1)ホルマリン固定試料における遺伝子の断片化への対処、(2)少量の検体から炎症性細胞を選択的に回収する手技の確立、(3)診断に応用するための遺伝子データ解析フローの確立、が課題としてあげられた。
27年度は、(1)への対処としてQiagen社のPAXgene tissue containerを用い、DNAやRNAを断片化することなく標本作製と遺伝子解析が行える固定方法を試した。(2)に対しては、レーザーマイクロダイセクションにより選択的に回収した微量な細胞からも次世代シーケンスで遺伝子解析が可能か検討した。(3)に対しては、次世代シーケンスで得られた遺伝子データを臨床応用するための診断向け解析に特化したPC用OS(DIAGNO Linux)の開発を行った(http://www.diagnolinux.com)。
その結果、Qiagen社のPAXgene tissue containerを使用することでFFPE試料と同等の形態観察と、新鮮材料と同等の遺伝子解析が可能となった。マイクロダイセクションで回収した微小サンプルでも遺伝子抽出は可能で、DIAGNO Linuxを用いて遺伝子解析環境を容易に構築してデータ解析が行えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定では、滑膜細胞を初代培養して炎症性サイトカイン、結晶性関節炎を惹起する種々のリン酸カルシウム、および滑膜軟骨腫症で発現しているBMP-2、アグリカン、II型コラーゲンに対する滑膜細胞の反応性を調べることを計画していた。しかし、分担研究者が年度の後半から1年間の海外出張に出たことや、過去の本研究テーマにおける共同研究者が退職したことで、新たな関節洗浄液の採取が困難となった。そこで今年度は「顎関節症の分子細胞レベルでの総合的診断システムの構築」に必要な手技の確立と、臨床応用に必要な遺伝子解析に特化したPC用OSの開発を先に行った。本学生化学講座で昨年、ラットの滑膜細胞株の樹立に成功し、次年度は本研究用に供与してもらうことが決まった。
研究の順序が当初の計画と少し変わったが、現在までに微小検体をホルマリン固定を行わずに形態観察と遺伝子解析を行う手技を確立し、マイクロダイセクションによる目的細胞の選択的回収後の次世代シーケンスによる遺伝子解析も可能となった。さらに本検査法を臨床応用するための遺伝子解析のためのPC用OSもUbuntu Linuxベースで開発することができた。
以上より、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、本学生化学講座で樹立したラットの滑膜細胞の供与を受け、最初に網羅的遺伝子発現解析を行い細胞特性を調べる。次に、顎関節症や顎関節疾患に関連する病原因子に対する反応性を、次世代シーケンスによるトランスクリプトーム解析で調べる。
次世代シーケンスで得られた遺伝子データの解析には種々の解析用ソフトを組み合わせて行うが、ほとんどのソフトが一般に用いられているウィンドウズOSではなくLinux OSで開発されている。そのため、解析環境の構築には専門的な知識が必要となる。今年度は解析に必要な解析ソフトを全てプレインストールすることでデータ解析環境の構築を容易にするDIAGNO Linuxを開発した。次年度はグラフィカルユーザーインターフェースを使って誰でも簡単に操作でき、しかも遺伝子解析結果から自動で臨床応用に必要なデータを選択的に出力させられるソフトの開発を行う。今年度開発したDIAGNO Linuxは誰でも無償で自由に使用できるように、www.diagnolinux.comで公開している。
次年度は本研究計画の最終年度であるため、顎関節症患者からの関節洗浄液の採取から、形態観察、網羅的遺伝子発現解析を行って臨床応用するまでの一連のシステムを完成させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分担研究者が年度後半から1年間の海外出張に出たこと、過去の本研究テーマにおける共同研究者が退職したことで、新たな関節洗浄液の採取が困難となった。そこで今年度は「顎関節症の分子細胞レベルでの総合的診断システムの構築」に必要な手技の確立と、臨床応用に必要な遺伝子解析に特化したPC用OSの開発を先に行った。そのため研究の順序が当初の計画と一部変更になったことで予算使用学が変わり、次年度使用学が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本学生化学講座で樹立したラットの滑膜細胞株を本研究用に供与してもらうことが決まったので、次年度はこの滑膜細胞株を用いて網羅的遺伝子発現解析を行い細胞特性を調べる。次に、顎関節症や顎関節疾患に関連する病原因子に対する反応性を、次世代シーケンスによるトランスクリプトーム解析で調べるのに用いる。
今年度開発したDiagno Linuxはコマンドラインでの操作となるため、グラフィカルユーザーインターフェースを付与することで、次世代シーケンスで得られた遺伝子データを誰でも簡単に解析して臨床に応用きるように改良するための開発費用に用いる。
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| 備考 |
本研究予算により開発中の遺伝子解析に特化したPC用OSのディストリビューションです。開発したソフトウェアは本ページから無償でダウンロードして使用可能です。現時点でwebページを公開していますが、制作途中のため随時更新していく予定です。
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