| 研究課題/領域番号 |
26463087
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
KA 井上 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (90302877)
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| 研究分担者 |
渡 一平 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10431941)
粂井 康宏 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 講師 (30161714)
横山 三紀 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (70191533)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | プロテオグライカン / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
ヘパラン硫酸プロテオグライカン (HSPG) は細胞外マトリックスの主要な活性分子の一つであり、骨組織では破骨細胞分化因子（RANKL, TGF-β）との相互作用が知られている。また、HSPGは、細胞外での機能に加えて、細胞表面から細胞内への巨大分子の取り込みにも関与する。最近、HSPGはエクソソームという膜小胞体の取り込みに関与している可能性が示唆された。エクソソームは多くの細胞から分泌をされ、細胞間の情報伝達や分子の転送に重要な役割を持ち、組織再生プロセスの過程で重要な役割を果たしている事が報告されている。本課題では、新薬の標的としてこのエクソソームに注目し、通常状態と骨形成因子で活性化させた状態の骨芽細胞および破骨細胞由来のエクソソームキャラクタリゼーション及びHSPGによるエクソソームの取り込みに関する以下の実験を行った。①生化学的及び生物学的手法を用いて、種々の前骨芽細胞（MC3T3-E1、ST2、KUSA-A1細胞など）及び破骨細胞（RAW246）におけるHSPGの発現を調べた。②昨年度に確立した、OptiPrep 密度勾配遠心法に基づいたエクソソーム精製方法を用いて、種々の通常条件の下で培養した前骨芽細胞からエクソソームを精製し、そのエクソソームのキャラクタリゼーションを行った。③様々なエクソソームのマーカー分子としてTSG101、ALIX、Hsp70、Annexin2、Flottilinなどの検出条件を検討・確立し、各細胞における発現及びエクソソームにおける局在を調べた。④前骨芽細胞 (MC3T3-E1)を用いて、エクソソームの細胞内取り込みにおけるHSPGの役割の解明するために、HSPGのsiRNA実験検討を行った。現在、分化誘導有り・無しの状態における前骨芽細胞由来エクソソームのキャラクタリゼーション及びエクソソームの細胞内取り込みをリアルタイムで観察するモデルの作成が進行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
やや遅れている。理由としては、①前骨芽細胞におけるエクソソームのマーカータンパク質を検出するための詳細な条件検討、②前骨芽細胞の分化誘導の細胞培養条件の至適化検討 (細胞：MC3T3-E1だけでなくST2、KUSA-A1のモデルも確立、分化誘導因子：vitamin D3からグリセロリルリン酸及びアスコルビン酸に変更など)、③エクソソームの精製方法の条件検討を実施する必要が生じたため、遅れが生じた。結果、前骨芽細胞を効率的に分化させ、その細胞におけるHSPGやエクソソームのマーカータンパク質を検出するための完成度の高いプロトコールを確立することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、昨年度できなかった以下の実験を行う。① 前骨芽細胞MC3T3-E1に分化誘導因子 (グリセロリルリン酸及びアスコルビン酸) を処置して分化させ、そこからエクソソームを精製する。液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC/MS法) を用いて、エクソソームに存在するタンパク質を同定する。② ①と同様の手法を用いて、他の前骨芽細胞 (ST2細胞やKUSA-A1)におけるエクソソームに存在するタンパク質を同定する。③ ①、② において精製されたエクソソームの膜を蛍光色素PHK67で蛍光標識し、各細胞 (MC3T3-E1、ST2、KUSA-A1) へのエクソソームの取り込みに及ぼすHSPGの効果を共焦点顕微鏡で観察する。④ 次に、様々なHSPGに対するsiRNAを用いて、細胞へのエクソソームの取り込みに重要な役割を持つHSPGを特定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験の遅れが発生したため、昨年度の使用額が予定よりも少なく、代わりに次年度使用額が生じた。また、抗体をキャンペーン価格で購入できたため、予定よりも予算が残った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験の遅れにより昨年度実施することができなかった前項①及び②の実験 (LC/MS法を用いたエクソソームに存在するタンパク質の同定) を行うため、質量分析用の試薬が必要。さらに、前項③ (共焦点顕微鏡を用いた観察) において、エクソソームの精製に必要な試薬、及びエクソソーム膜の可視化のための蛍光標識試薬や抗体が必要。また、質量分析機器や共焦点顕微鏡が設置されている本学共同実験設備の分析機器使用料のために経費が必要である。さらに、今年度の日本生化学会学大会で研究成果発表を行う予定であり、旅費が必要。
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