| 研究課題/領域番号 |
26463100
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
中嶋 昭 日本大学, 歯学部, 助教 (50297842)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | TGF-β / 口蓋裂 / 二次口蓋 / 分子生物学 / 成長・発育 |
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| 研究実績の概要 |
【目的】TGF-β受容体（TβR）は3種の異なるisoformが存在し、二次口蓋癒合上皮(MEE)ではそれらの強い遺伝子発現を認めることが明らかとなっている。しかし、３種いずれのknockoutマウスでも、胎生期の口蓋癒合前に死亡することが報告されている。そこで、siRNAにて各受容体をknockdownさせた際の二次口蓋癒合過程を観察し、さらにMEEに強い発現を認めるTGF-β下流遺伝子Smad２のリン酸化への影響、およびTGF-β3 knockoutマウスでMEEにおける発現が減少するMMP-13についても検討を行った。【試料および方法】胎生13日のマウス口蓋の器官培養にて、それぞれ受容体のsiRNA (siTβR-I, -II, -III)をtransfectし、72時間培養した。Control群については、control siRNAをtransfectした。口蓋癒合については顕微鏡下で観察した。マウス口蓋MEEを採取後、p-Smad2の発現量の相違についてはSDS-page Western blot法にて、MMP-13の遺伝子発現についてはreal time RT-PCR法にてcontrol群とsiTβR群との比較を行った。【結果および考察】300 nM siTβR-I, -II, -III群では、control群と比較し、target受容体の発現を85%以上抑制した。口蓋癒合については、control群が癒合完了している72時間後で、いずれのsiTβR群においても癒合不全が生じており、siTβR-Iおよび-II群はsiTβR-III群に比べて癒合不全を生じる率が高かった。p-Smad2の発現は、control群に比較して、いずれのsiTβR群も有意に減少し、さらにsiTβR-I群および-II群の方が、siTβR-III群より有意に減少していた。一方、MMP-13発現も、siTβR-I群および-II群ではcontrol群と比較して有意に減少し、siTβR-III群では影響は少なかった。以上より、二次口蓋癒合には、TβR-IIIよりも、TβR-IおよびTβR-IIが下流遺伝子に及ぼす影響が大きかった。【結論】口蓋癒合には、すべての受容体の機能が関与しており、特にTβR-IおよびTβR-IIの影響が大きいことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1．Small interfering RNA (siRNA) 処理下における二次口蓋成長発育の観察：胎生13日目のマウス口蓋突起のみ摘出し，フィルター上に試料をのせ，濃度300nMのTGF-β type I, type II, type III receptor (TβRI, TβRII, TβRIII) それぞれのsiRNAをBGjb medium (Gibco) 溶液に入れorgan cultureを72hまで行う。
2. MEE細胞の単離およびreal-time RT-PCRによるmRNA発現の定量解析：MEE細胞を単離を行った後、mRNA extraction kit（Quiagen）を使用し，MEE細胞のmRNAの抽出を行う。抽出したmRNAより1 st strand RT-PCR法でcDNA合成を行う。PCR primerを設計合成し，Quantitative real time RT-PCR法により上記遺伝子の増幅を行い，遺伝子発現を検討する。
3. Western blot法によるTGF-β receptor遺伝子タンパク発現の定量解析：胎生13日目のマウス二次口蓋をsiRNA処理し，organ cultureしたsampleを，lysis bufferにてhomogenizeを行い，SDS-page Western blot 法にて，Target遺伝子タンパク発現量をコントロールと比較し確認を行う。また，濃度依存性であるかどうかについても検討を加える。
4. HE染色による二次口蓋の組織学的観察：上記の手法にてsiRNAを含有したmediumにて二次口蓋のorgan cultureを行い、E13+24h, E13+48h, E13+72hの培養時間で4% paraformaldehydeで固定した後，凍結切片を作製し，HE染色を行う。それぞれのreceptorをknock downした際の二次口蓋の癒合状態について光学顕微鏡にて観察を行なう。
以上1～4に記載した「研究の目的」について、マウス胎児E13の二次口蓋についてTβRI, TβRII, TβRIIIのsiRNAを反応させ、72時間まで培養を行い、Western blot法にてそれぞれのreceptorの発現が抑制されているか確認し、siRNAの濃度依存的にreceptorのタンパク発現は減少し、300nMの濃度のsiRNA transfection条件下で、両receptorを約80%の発現抑制することを確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度に得られた結果を基にして，平成27年度以降はsiRNA処理した際の，二次口蓋の免疫染色にてdown stream遺伝子の観察を行う。リン酸化タンパク発現量についてはWestern blot (SDS-page)法にて調べ，転写因子の遺伝子発現についてはQuantitative real time RT-PCR法にて検討を行う。
1. 免疫染色: siRNAでtransfectしたorgan cultureにて得られたサンプルを4% paraformaldehydeで固定した後，凍結切片を作製し，Zymed immunohistochemistry kit にてdown stream 遺伝子の免疫染色を行い発現を観察する。
2. Down stream遺伝子のタンパク発現: siRNAのtransfect確認後，Smad2およびSmad3等のSmad-dependent遺伝子のphosphorylation，TAK/MLK3/MEKK1からJNKおよびp38のsignaling pathwayもしくはERK1/2に代表されるMAPK等のSmad-independentのsignaling pathwayについても観察を行う。
3. Down stream遺伝子の遺伝子発現: siRNAのtransfect確認後，二次口蓋の成長に関与しているとされているMsx, Tbox, Runx等のTranscription factorの遺伝子発現について、TGF-βのreceptorがそれぞれknock downした際、どのように影響するかについて、real time RT-PC法にて調べ，二次口蓋癒合時のTGF-β signalingの全容について明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度に申請した予算のうち、各種抗体およびSmall interfering RNA合成費について購入会社および業者の変更を行った結果、予定より減額となった。また、特定の抗体もしくはsiRNAを合成した場合、必ずしも１種類の抗体やsiRNAでタンパク発現のDetectionや遺伝子のDeletionが可能でない場合もあり、同遺伝子で何種類かの抗体およびsiRNAの合成費用を見積もっていた。しかし、予定より少ない量で実験が可能となり70万円程度の支出残金となった。平成26年度は、試薬やkitを新たに購入し、サンプル数を増やし、dataの確認を行うとともに、TGF-βのdown stream遺伝子であるSmad-dependentおよびSmad-independent pathwayのsignalingについて焦点をあて、タンパク発現および遺伝子発現をコントロール群と比較検討を行う予定である。さらに、knock down した際のMEEのcell proliferationについても研究を広げる予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
胎生13日目のマウス口蓋を濃度300nMのsiRNAを含有したBGjb medium (Gibco) 溶液にて5-bromo-2deoxyuridine (BrdU)を反応させ、72時間までorgan cultureを行う。その後、サンプルを固定しパラフィン切片を作製する。BrdU detecting kit (Zymed) にて染色を行い、陽性細胞ついてカウントし、cell proliferationについてコントロールと比較する。Apoptosisのdetectionには、TUNEL in situ cell death detecting kit (Rosche) を使用し、同様に陽性細胞のカウントを行い、コントロールと比較検討する。以上、実験動物、siRNA合成料、抗体、各種detecting kitおよび汎用試薬等の物品費の購入が必要となる。
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