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１： p130Cas欠損マウス骨髄細胞から誘導した破骨細胞にFLAGタグ付き野生型p130Casおよびp130Casの機能に重要なSH3領域を欠失した変異体を遺伝子導入し、細胞内タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を抗FLAG抗体で免疫沈降を行い、質量分析より野生型p130Casと会合し、変異型とは会合しない分子群を選別した。さらに、それらの分子群より機能的に未知でタンパク質の一次構造より破骨細胞の形態に関与すると考えられるBif-1に着目した。２：野生型マウス骨髄細胞を採取し、M-CSFとRANKLを加え破骨細胞に分化させ、破骨細胞におけるBif-1の発現と局在を確認した。３：shRNAを用いてBif-1をノックダウンすることにより破骨細胞におけるBif-1の機能を検討した。
４： Dr. Takahashi(Penn State University)と共同研究を行い、Bif-1欠損マウスの骨を供与され、骨形態計測をおこなった。
結果
質量分析から得られた複数の候補分子の中から、文献やデータベースの情報よりBif-1に着目して検討することにした。Real-time PCR法およびWestern Blot法により、Bif-1が破骨細胞に発現していることを確認した。さらに、免疫染色によりBif-1が骨吸収に重要な細胞骨格構造であるアクチンリングに局在することを確認した。
破骨細胞前駆細胞にshRNAを導入し、Bif-1をノックダウンするとアクチンリング形成が抑制された。野生型およびBif-1欠損マウス大腿骨のμCTおよびpQCTを撮影したところ、Bif-1欠損マウスの大腿骨は野生型マウスに比べ骨密度が増加していた。
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