| 研究課題/領域番号 |
26463148
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| 研究機関 | 松本歯科大学 |
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研究代表者 |
吉成 伸夫 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (20231699)
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| 研究分担者 |
小出 雅則 松本歯科大学, 付置研究所, 講師 (10367617)
武藤 昭紀 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (50549433)
田口 明 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70243582)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯周炎 / 心臓血管疾患 / 老化 |
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| 研究実績の概要 |
加齢に伴う生物学的老化は，心臓血管疾患(cardiovascular disease: CVD)に対する最も有力な危険因子である。しかし，加齢とCVDの原因となる動脈硬化症を結びつけるメカニズムはまだ解明されていない。本研究では，急性炎症マーカーである血清アミロイドA(SAA)，およびその受容体シグナルが血管老化に大きく関与していると考え，血管内皮細胞における老化に関わるSAA受容体の解析，SAAのシグナル抑制による高齢モデルマウスに対する老化抑制効果を解析することにより，SAAを介する歯周病から動脈硬化症の悪化機序から，生物学的老化へのメカニズムの詳細を明らかにすることを目的とする。平成26年度は，ドナーが27歳のヒト大動脈内皮細胞を長期培養し，以下の如く発現亢進するSAA受容体、老化マーカーの遺伝子発現をリアルタイムPCR法にて確認した。
1 ヒト大動脈内皮細胞(HAECs)を専用培地で12穴プレートに播種し，10，20日間培養を行った。
2 HAECへのヒトリコンビナント SAA(hSAA)の添加：培養開始後、培地交換時(2日毎)に25μg/mlの濃度のhSAAを添加し，実験群とした。また，無添加群を対照群とした。
3 SAA添加による SAA受容体の発現確認：(2)の細胞からmRNAを抽出した。抽出後に逆転写，cDNAに変換し，リアルタイムPCR法にてSAA受容体(TLR2，TLR4，CST3，ABCA1，ABCA7，CD36，SCARB1，FPR2，AGER)の発現を確認した。
4 SAA添加による老化マーカーの発現の確認：(3) と同様に(2)の細胞からmRNAを抽出した。TERT(テロメラーゼ逆転写酵素), p53，p16発現をリアルタイムPCR法にて，SAA添加群と対照群について比較した。β－GALは,細胞融解後，検出キットにて測定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は，主に2つのことを検討した。１つは、大動脈血管内皮細胞のSAA受容体の確認である。
すなわち、ヒト大動脈血管内皮細胞(HAECs)を長期間継代培養し，HEACsに発現するSAA受容体遺伝子およびタンパク発現をreal-timePCR法にて確認した。２つ目は，SAA刺激による老化への影響の解析であり，HAECにSAAヒトリコンビナントタンパクを添加し，長期間継代培養を行い，老化マーカー遺伝子(テロメラーゼ，p53，p16)，およびβ－GALタンパク発現をreal-timePCR法にて確認し，SAA非添加群と老化マーカーの発現を比較した。
その結果，SAA添加による SAA受容体の発現に関しては，TLR2が10日，20日において強発現し(15～30倍)，TLR4で弱発現(1.5～2倍)，その他のSAA受容体(CST3，ABCA1，ABCA7，CD36，SCARB1，FPR2，AGER)は発現しなかった。
また，SAA添加による老化マーカーの発現の確認に関しては，β-GAL，テロメアーゼ，p53，p16発現において実験群と対照群とで有意な差は認められなかった。
すなわち，今回の結果ではSAAの受容体は，TLR2であることが確定されたが，若いドナーの細胞を使用したため，老化マーカー遺伝子発現亢進を確認できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
HAECsの長期間培養は，ほぼ順調に出来ているが，今回のドナーは27歳と若いので，次回は81歳ドナーのHAECsを追加して実験に使用する。ただ，その際に細胞の接触抑制が危惧されるので，90%コンフルエント以下の状態で継代する予定である。さらに，リアルタイムPCR法でのp16発現に関しては，dissociation curveが２相になっており非特異的増幅が疑われるのでプライマーを設計しなおす，TERTに関しては増幅の立ち上がりが遅いので，40サイクル以上の増幅回数に増やしてみる予定である。
これでも対照群と有意差が認められなかった場合，若年期(生後8週齢)，および高齢期(生後10ヶ月)のApoEノックアウトマウスの大動脈から内皮細胞を採取し，すなわちマウスの血管内皮細胞に変更して研究を行うこととする。高齢期ApoEノックアウトマウス大動脈内皮細胞は，受容体を高発現していることを確認しているので，有意差が認められると推測される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
高齢ドナーの大動脈内皮細胞を購入して、研究を継続する予定であったが、高齢ドナーが昨年は見当たらず、１０万円程度するので、市場に出てきたらすぐに購入できるように繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
高齢ドナーが市場に出てきたらすぐに購入する。
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