| 研究課題/領域番号 |
26463171
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| 研究機関 | 東京歯科大学 |
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研究代表者 |
菊池 有一郎 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (30410418)
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| 研究分担者 |
石原 和幸 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (00212910)
柴山 和子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (60408317)
国分 栄仁 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (70453785)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯周病原細菌 / Porphyromonas gingivalis / シグマ因子 / ECFシグマ因子 / 転写因子 / 環境ストレス / バイオフィルム / ジンジパイン |
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| 研究実績の概要 |
１．PGN_1740変異株のバイオフィルム形成増加に関与する遺伝子の同定
我々は最初にPGN_1740変異株におけるバイオフィルム形成増加に線毛が関与するとの予測をたて、P. gingivalis線毛遺伝子（fimA, mfa1）の転写量をリアルタイムPCR法により解析を試みた。その結果、野生株とPGN_1740変異株において両遺伝子の転写量は同程度であった。また、PG1827変異株において線毛発現に関与する二成分制御系の構成タンパクFimSの転写量が増加するという現象がすでに他グループにて報告されており、我々も同様の解析を試みた。だが、野生株とPGN_1740変異株においてfimSの転写量は同程度であった。これらの結果よりPGN_1740変異株のバイオフィルム形成量の増加は、線毛以外の要因に起因する可能性が示唆された。次に、線毛以外にバイオフィルム形成に関与すると推測される遺伝子について野生株およびPGN_1740変異株にて転写量の変化をリアルタイムPCR法にて解析を試み、現在数種類の遺伝子を候補としてリストアップしている。
２．5種類のECFシグマ因子変異株におけるジンジパイン（Rgp, Kgp）活性測定
P. gingivalisの病原性に深く関与するジンジパイン（システインプロテアーゼ）Rgp, KgpとECFシグマ因子の関連性について解析を試みた。野生株（ATCC33277株）とECFシグマ因子変異株5種類を用い静止期におけるRgp, Kgp活性を測定した。その結果PGN_0274変異株にてRgp, Kgp活性の顕著な低下を認めた。この結果は、PGN_0274変異株が血液寒天培地上にて黒色集落を形成せず透明な集落を形成するという事実と矛盾しない結果となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２６年度の研究実施計画にて当初予定していた「バイオフィルム形成に関わるPGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群の解析」については、PGN_1740を中心に今年度は解析を行い、 PGN_0274についてはまだ解析していないという状況である。その理由として、本学に次世代シークエンサーが年度末に配置される予定であったため、配置後次世代シークエンサーを用いて研究を進める予定に変更を行ったためである。よって、次年度である平成２７年度にPGN_0274およびPGN_1740の支配下遺伝子の探索を次世代シークエンサーにて行うこととしている。
また、PGN_1740に関しては過去の報告より、支配下遺伝子として線毛関連遺伝子と他の数種類の遺伝子を推測することが可能であったため、その遺伝子についてリアルタイムPCR法にて解析を試みた。野生株とECFシグマ因子変異株にて変化が認められた遺伝子を候補として、PGN_1740が直接遺伝子の転写を調節しているのか、次年度２７年に解析を進めていく予定である。
平成２６年度の研究実施計画に予定していた「ジンジパイン分泌及び酸化ストレス回避におけるPGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群の解析」については、野生株と５種類のECFシグマ因子変異株にてジンジパイン活性を測定したところPGN_0274変異株にて顕著な減少を認めたので、上述の次世代シークエンサー解析にてその現象のメカニズムについてさらなる解析を試みる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．「PGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子のプロモーター解析、Chip-on-Chip解析」本研究初年度申請時から平成２７年度に予定していたPGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群のプロモーター解析については計画通り行う予定である。計画では前年度２６年に結果が得られているものと予定していた候補遺伝子に関しては、平成２７年度に次世代シークエンサーを用いて解析を進めてゆくので、その進行速度に応じて平成２８年度にまで持ち越される可能性もある。
２．「PGN_0274, PGN_1740支配下タンパクに関するプロテオーム解析」上記１の研究結果がタンパクレベルにおいても再現可能か、二次元ゲル電気泳動法による解析を行う予定である。
３．「PGN_0274, PGN_1740ECFシグマ因子と薬剤感受性との関連性」当初２８年度に計画していたECFシグマ因子とPorphyromonas gingivalisの病原性との関連について一部前倒しする形で、薬剤感受性とECFシグマ因子に関連性があるかないか解析する。実験方法としては、抗菌薬（細胞壁合成阻害剤、タンパク合成阻害剤、核酸合成阻害剤）を用い野生株とECFシグマ因子変異株のMICを測定することで比較検討することを予定している。
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