ストレス関連疾患における予防薬及び治療薬としてのポリフェノールの有効性の基礎解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26500022
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 豊平 由美子 産業医科大学, 医学部, 准教授 (90269051)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: Polyphenol / catecholamine / transporter / tyrosine hydroxylase / secretion / synthesis / channel

研究実績の概要

うつ病や不安障害等に古くから民間療法として用いられているメディカルハーブの主な機能成分であるポリフェノール類がストレス関連疾患の予防薬や治療薬として、機能しうる可能性のある食品機能成分を特定し、評価することを目的とした基礎研究である。
平成26年度は交感神経系機能のモデル系としての培養ウシ副腎髄質細胞とヒト神経芽細胞(SK-N-SH)を用いてカテコールアミン(CA)神経機能に影響するポリフェノールを新規に選定することであった。CA神経系を修飾する可能性のあるフィトケミカルが多数あることも明らかにした。
パセリ、セロリ、カモミール茶等に含まれるフラボンであるアピゲニンは、副腎髄質細胞におけるニコチン性アセチルコリン受容体や電位依存性ナトリウムチャネル、電位依存性カルシウムチャネル刺激を介したCA分泌を濃度依存性(3 -100 μM)に抑制した。アピゲニンはチロシン水酸化酵素のセリン31と40のリン酸化を促進した。アピゲニンはアセチルコリン刺激よるチロシン水酸化酵素のセリン31のリン酸化を抑制した。
生薬として使用されているイカリソウの成分の1つであるイカリソサイドAはニコチン性アセチルコリン受容体刺激によって引き起こされるCA分泌と細胞内への[Ca-45], [Na-22]イオン 流入を濃度依存性に抑制した。さらにアセチルコリン受容体刺激によるチロシン水酸化酵素活性やCA生合成も抑制した。カルノシン酸、テアニンやアントシアニン類はCA分泌に影響を与えなかった。
アピゲニンやイカリソサイドAは副腎髄質細胞において、CA分泌に関与するイオンチャネルの機能を阻害して、CA分泌を抑制することが示唆された。さらに、チロシン水酸化酵素のリン酸化に影響を及ぼすことも明らかになったが、その作用機序については検討中である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本年度の研究はおおむね計画に沿って遂行されていると考えているが、一部遅れが出ている分野が存在している。本年度の研究計画は培養ウシ副腎髄質細胞とヒト神経芽細胞(SK-N-SH)を用いてカテコールアミン(CA)神経機能に影響するポリフェノールを新規に検索することであった。フラボンのアピゲニンやフラボノールのイカリソサイドAがCA分泌に関与するイオンチャネルの機能を阻害して、CA分泌を抑制することを明らかにした。これらはニコチン性アセチルコリン受容体を抑制することから、中枢神経系機能をも修飾する可能性も示唆された。残念ながら、高速液体クロマトグラフィーのポンプに不具合が生じ、部品の供給が終了していたため修理が不可能であった。新規に購入することになり、調整・準備に時間が掛かったため、マウスでの摂取量・投与量と組織内濃度の検討に遅れが出ている。

今後の研究の推進方策

平成26年度に得られた結果を基にして、神経系への効果が確認されたポリフェノールについて細胞レベルと実験動物を用いた系での行動薬理学と生化学的手法を用いて評価を行う。①細胞レベルでのポリフェノールの作用部位・作用機序の解析の続きとして、細胞膜上NATやSERTへの[H-3]nisoxetine、[H-3]paroxetinを用いた結合実験を行い、結合部位の特定と、細胞膜上のNAT, SERTをビオチン化し、細胞膜上の発現変動をWestern Blotting法により測定することで、作用機序を検討する。②臨床効果発現における作用機序検索の足がかりとするため、神経芽細胞(SK-N-SH)や褐色腫瘍細胞(PC12)を用いて特定機能成分で刺激した時に作動する細胞内シグナルとして、ERK, Akt, GSK3βはリン酸化抗体を用いてWestern Blotting法により測定し、PKC, cAMP, cGMP, IP3はkitにて測定する大脳皮質,海馬,中脳における神経栄養因子タンパク質・mRNA量の変動を解析する。③投与群と対照群マウスの脳から分離したシナプトゾームへの モノアミンの取り込みを測定し、NAT, DAT, SERT機能への薬効を生化学的に検討する④マウスにおける神経伝達物質の変動を検討する。マウスの脳における細胞内シグナルを測定し、臨床効果発現の作用機序検索の足がかりとする。⑤対照群マウスと特定機能成分を腹腔内注射や経口投与したマウス群で 投与直後に行動解析を実施し、薬効を評価する。抗うつ効果の評価としてオープンフィールド試験・強制水泳試験・テールサスペンション試験を、抗不安効果の評価として高架式十字迷路試験・明暗箱試験を実施し、薬効の出現を評価する。⑥マウスにおける吸収、排泄率の解析を行い、マウスでの摂取量・投与量と組織内濃度との相関を明確にする。
以上の結果より、生体に於いてより大きな効果が期待される特定機能成分の選定や組み合わせを特定する。

次年度使用額が生じた理由

マウスにポリフェノールを投与または摂取させ、血中・組織内ポリフェノール濃度をHPLCにて測定して、投与・摂取量と組織内濃度の移行について検討する予定であった。しかしながら、2014年度後半にHPLCのポンプが故障して、新規に購入することになったため、組織内濃度測定の実験の実施が大幅に遅れた。その実験系で用いるはずであったマウスの購入予算が残り、次年度使用額50,560円が生じた。

次年度使用額の使用計画

分子生物研究用試薬、Western blot用試薬、ELISAキット、放射性標識化合物、HPLC用試薬等の研究用試薬、実験動物購入と研究用器具の物品費に65万円、実験動物管理費と大学所有機器の使用料等のその他費に40万円、国際及び国内学会関係の旅費に30万円を計上する。
昨年度の未使用の金額50,560円については遅れているマウス組織内ポリフェノール濃度のHPLCによる検討のために用いるマウスの購入に追加配分する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Effects of various pharmacological agents on the function of norepinephrine transporter (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoh N, Toyohira Y, Takahashi K, Yanagihara N
  • 雑誌名: J UOEH 巻: 37 ページ: 33-42
  • DOI: 10.7888/juoeh.37.33.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of an experimentally useful model of acute myocardial infarction: 2/3 nephrectomized triple nitric oxide synthases-deficient mous (2014)
  • 著者名/発表者名: Uchida T, Furuno Y, Tanimoto A, Toyohira Y, Arakaki K, Kina-Tanada M, Kubota H, Sakanashi M, Matsuzaki T, Noguchi K, Nakasone J, Igarashi T, Ueno S, Matsushita M, Ishiuchi S, Masuzaki H, Ohya Y, Yanagihara N, Shimokawa H, Otsuji Y, Tamura M, Tsutsui M
  • 雑誌名: J Mol Cell Cardiol 巻: 77 ページ: 29-41
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2014.09.021.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nitric oxide exerts protective effects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice (2014)
  • 著者名/発表者名: Noguchi S, Yatera K, Wang KY, Oda K, Akata K, Yamasaki K, Kawanami T, Ishimoto H, Toyohira Y, Shimokawa H, Yanagihara N, Tsutsui M, Mukae H
  • 雑誌名: Respir Res. 巻: 15 ページ: 92
  • DOI: 10.1186/s12931-014-0092-3.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] アセチルコリン刺激によるカテコールアミン分泌に対するフラボノール配糖体の効果：ウシ副腎髄質細胞での検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 李 暁佳、豊平由美子、堀下貴文、高橋圭太、吉永有香里、上野 晋、筒井正人、喜多大三、柳原延章
  • 学会等名: 第88回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（愛知県・名古屋市）
  • 年月日: 2015-03-18 – 2015-03-20
• [学会発表] Ikarisoside Aのカテコールアミン分泌及び生合成に及ぼす影響 (2014)
  • 著者名/発表者名: 李 暁佳、豊平由美子、堀下貴文、高橋圭太、帳 晗、吉永有香里、飯沼宗和、佐藤教昭、上野 晋、筒井正人、佐多竹良、柳原延章
  • 学会等名: 第67回日本薬理学会西南部会
  • 発表場所: 産業医科大学ラマツィー二ホール（福岡県・北九州市）
  • 年月日: 2014-11-23
• [学会発表] ウシ副腎髄質細胞におけるチロシン水酸化酵素とカテコールアミン分泌に及ぼすアピゲニンの影響 (2014)
  • 著者名/発表者名: 馬場宏佳、松田有希、豊平由美子、李 暁佳、吉永有香里、高橋圭太、柳原延章
  • 学会等名: 第67回日本薬理学会西南部会
  • 発表場所: 産業医科大学ラマツィー二ホール（福岡県・北九州市）
  • 年月日: 2014-11-23
• [学会発表] カテコールアミン神経系に及ぼすアピゲニンの影響：培養ウシ副腎髄質細胞での検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 松田有希、馬場宏佳、豊平由美子、李 暁佳、吉永有香里、高橋圭太、柳原延章
  • 学会等名: 第7回トランスポーター研究会九州部会
  • 発表場所: 産業医科大学ラマツィー二ホール（福岡県・北九州市）
  • 年月日: 2014-11-22
• [学会発表] 培養ウシ副腎随質細胞におけるカテコールアミン分泌に対する植物性フラボノイドの作用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂巻路可，豊平由美子，李 暁佳, 小原 剛，稲垣博英，高橋圭太，柳原延章
  • 学会等名: 第7回トランスポーター研究会九州部会
  • 発表場所: 産業医科大学ラマツィー二ホール（福岡県・北九州市）
  • 年月日: 2014-11-22
• [学会発表] モノアミントランスポーターに対する脳循環代謝改善薬・ニセルゴリンの効果 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤英明，豊平由美子，松嶋康之，佐伯覚，上野 晋，蜂須賀研二，柳原延章
  • 学会等名: 第7回トランスポーター研究会九州部会
  • 発表場所: 産業医科大学ラマツィー二ホール（福岡県・北九州市）
  • 年月日: 2014-11-22