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2015 年度 実施状況報告書

マルトシル-βシクロデキストリンのニーマンピックC型病治療への展開

研究課題

研究課題/領域番号 26505012
研究機関武庫川女子大学

研究代表者

岡田 安代  武庫川女子大学, 薬学部, 講師 (70211117)

研究分担者 市川 厚  武庫川女子大学, 薬学部, 教授 (10025695)
入江 徹美  熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (60150546)
竹山 志朱代 (堀山)  武庫川女子大学, バイオサイエンス研究所, 助教 (80411982)
西川 淳一  武庫川女子大学, 薬学部, 教授 (90218131)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードニーマンピック病C型 / マルトシル‐βシクロデキストリン / コレステロール
研究実績の概要

【目的】Niemann-Pick病C型(NPC)は、遺伝子変異によりコレステロール(Cho)輸送を制御する遺伝子産物NPC1が欠損し、Choがリソソーム内に蓄積する遺伝子疾患である。生体内の主要物質であるChoレベルは、ABCトランスポーター(ABCA1, ABCG1)、核内受容体(PPARγ, LXRα)、LDL受容体(LDLR)、膜結合型転写因子(Srebf2)等のCho輸送関連遺伝子によって、恒常性を維持する為に厳密に調節されている。本研究では、NPC病態モデルNPC1欠損細胞のChoレベル調節化合物の検索を目的に、Choとの包接作用を有する6-O-α-maltosyl-βcyclodextrin(Mal-βCD)とそのCho包接化合物(Cho/ Mal-βCD)を用いて、上記の遺伝子のmRNA量の変化を調べた。
【方法】細胞:NPC病態モデルNPC1欠損細胞としてNPC病患者由来皮膚線維芽細胞(GM03123; NPC1-A, GM18436; NPC1-B)、対象細胞として健常者由来皮膚線維芽細胞(GM05659; Normal)を使用した。細胞Choレベルの調節:細胞を播種しMEM培地(10%FBS)で48時間培養後、MEM培地(FBS不含)に替え、Mal-βCD(5mM)を添加(細胞Choレベル低下)又はCho/Mal-βCDを添加(細胞Choレベル上昇)し、6時間後の各遺伝子のmRNA量をRT-PCRで調べた。
【結果・考察】ABCA1トランスポーターによるChoの排出機構は、NPC1欠損細胞においても正常に機能していることが示唆された。LDLR mRNAはChoレベル低下により顕著に増加したが、Choレベル上昇では変化がなくCho/Mal-βCDによる細胞内へのChoの取り込みへの関与は低いと考えられる。LXRα mRNAはChoレベルの変動により変化は見られなかった。Choレベル上昇によりNPC1欠損細胞のPPARγ mRNAは増加したが、正常細胞では変化がなく、一方、Choレベル低下により正常細胞のSrebf2 mRNAは増加したがNPC1欠損細胞では変化が無かった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度は、ニーマンピック病C型の病態細胞として、retrovirus-mediated gene trap mutagenesisでNpc1遺伝子を破壊したChinese hamster ovary 細胞(NPC1 KO, A101)を用いて6-O-α-maltosyl-βcyclodextrin(Mal-βCD)によるNPC病態細胞の高コレステロールレベルの低下とMal-βCDのNPC病態細胞への取り込みについて調べた。今年度は、初年度の成果を基盤にMal-βCDのNPC病態細胞への取り込み機構について詳細に調べた。また、Human由来のニーマンピックC型病患者由来の細胞を使用して、Mal-βCDによる「NPC1欠損細胞における細胞コレステロールレベル変化によるコレステロール放出因子の影響」について着手することが出来た。

今後の研究の推進方策

平成26年度、平成27年度の成果を基盤に以下の実験を計画している。
1.センダイウイルスベクターを用いてNPC由来皮膚線維芽細胞からiPS細胞の樹立が可能である。iPS細胞を肝様細胞へ分化させ、NPC病態モデルとして使用できることは実証されている。iPS細胞の分与を受け、以下の実験を実施する。
(1)Mal-βCD処理によるフリーコレステロールとエステル型コレステロールの影響。(2)Mal-βCDの細胞内への取り込みと細胞外排出.
2. NPC病の原因遺伝子であるNpc1のヘテロ欠損(Npc1+/-)およびホモ欠損(Npc1-/-)マウスにMal-CDを投与し、生存率、血清生化学パラメータ、主要臓器の病理学的評価などを行う。

次年度使用額が生じた理由

本研究の主たる実験方法は、Niemann-Pick病C型(NPC)の病態細胞を使用する細胞実験である。Niemann-Pick病C型(NPC)の病態細胞の一つである、Human由来のNPC病態細胞は高価であり、細胞の継代数が限られている。また、細胞継代に特別な培地を必要とするなど、細胞を維持していくためには高額な経費が必要である。この点を考慮して、平成27年度に細胞培養に必要な経費を計上していたが、分担研究者からNPC病態細胞の恵与があった。細胞購入に充当していた費用は、「NPC1欠損細胞における細胞コレステロールレベル変化によるコレステロール放出因子の影響」を調べる実験で使用する、細胞培養試薬、遺伝子実験試薬などの経費として次年度請求する。

次年度使用額の使用計画

平成27年度に着手したHuman由来のNPC病態細胞を使用して、「NPC1欠損細胞における細胞コレステロールレベル変化によるコレステロール放出因子の影響」をアゴニスト、アンタゴニストなどを使用して、さらに詳細に調べる予定である。現在、NPC病の早期診断法は確立されていなない。NPC病の特徴の一つに、細胞内のコレステロールとコレステロールエステル体のバランス異常が挙げられる。LC/MSによるコレステロールとコレステロールエステル体の定量法を確立し、NPPC病の迅速な診断法の開発する。本実験には、LCカラム、移動相、サンプル瓶などのLC/MS経費が必要である。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2016 2015

すべて 学会発表 (4件)

  • [学会発表] 6-O-α-Maltosyl-β cyclodextrinによるNiemann-Pick 病Type Cの病態モデル、NPC1欠損細胞のコレステロール輸送関連遺伝子の発現量変化2016

    • 著者名/発表者名
      岡田安代、上田恵梨香、古本奈津子、近藤悠希、石塚洋一、入江徹美、東 大志、本山敬一、有馬英俊、松尾宗明、檜垣克美、大野耕策、西川淳一、市川厚
    • 学会等名
      日本薬学会第136年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県・横浜)
    • 年月日
      2016-03-29
  • [学会発表] Niemann-Pick病Type Cの病態モデル、Npc1欠損細胞の6-O-α-maltosyl-βcyclodextrinによるリソソームへの取り込みとコレステロールレベルの変化2016

    • 著者名/発表者名
      上田恵梨香、岡田安代、近藤悠希、石塚洋一、入江徹美、東 大志、本山敬一、有馬英俊、松尾宗明、檜垣克美、大野耕策、市川 厚、西川淳一
    • 学会等名
      日本薬学会第136年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県・横浜)
    • 年月日
      2016-03-27
  • [学会発表] Niemann-Pick病C型に対する2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrinの作用発現とエンドサイトーシスの関連2015

    • 著者名/発表者名
      松本朋子、近藤悠希、山縣美月、石塚洋一、岡田安代、、西川淳一、市川厚、東 大志、本山敬一、有馬英俊、松尾宗明、檜垣克美、入江徹美、
    • 学会等名
      第32回日本薬学会九州支部会
    • 発表場所
      九州保健福祉大学(宮崎県・延岡市)
    • 年月日
      2015-11-28
  • [学会発表] Niemann-Pick病Type Cの病態モデル、Npc1欠損細胞のリソソームへの6-O-α-maltosyl-βcyclodextrinの取込み2015

    • 著者名/発表者名
      上田恵梨香、岡田安代、近藤悠希、石塚洋一、入江徹美、東 大志、本山敬一、有馬英俊、松尾宗明、檜垣克美、大野耕策、市川 厚、西川淳一
    • 学会等名
      日本薬学会近畿支部会
    • 発表場所
      大阪大谷大学薬学部(大阪府・富田林市)
    • 年月日
      2015-10-17

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公開日: 2017-01-06  

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