| 研究課題/領域番号 |
26550028
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
井倉 正枝 京都大学, 放射線生物研究センター, 研究員 (40535275)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | DNA損傷記憶 / ヒストン化学修飾 / クロマチン構造変換 / クロマチン免疫沈降 |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、修復されたDNA周辺のヒストンの化学修飾とクロマチン構造に着目し、DNA損傷記憶の実体を明らかにすることが目的である。IL2-R/DRGFPカセット発現細胞をU2OS細胞で作成し、I-Sce1によるDNA二本鎖切断を行い、DNA修復が完了したことを示すGFP Positeve細胞をマグネットビーズを付与したIR2-Rの抗体でsortingした。結果は、sortingによりGFP-positiveな細胞を得ることには成功したが、効率が予想より大きく下回り、細胞が増えるまで長期間を要した。I-Sce1の導入効率を上げる必要がある。クロマチン免疫沈降によるヒストンの化学修飾を検討する系はすでに定まっているので、ヒストンH2AXのリン酸化、ヒストンH2AXおよびH4のアセチル化抗体について検討した。ここで考慮すべき問題は、IL2-R/DRGFPカセットが挿入されている領域が、ヘテロクロマチン領域かあるいはユークロマチン領域かで得られる結果に違いが生じる可能性があるので幾つかのクローンで検討することも始めた。H2AXのアセチル化は、当初は、リジンの5番目の部位でのアセチル化に着目していたが、その後の解析によりアセチル化される部位が他にもあり、それが放射線障害によりDNA損傷領域で変化するかを見る必要がある。これはH4のアセチル化にも同様なことが当てはまり、リジン16番目のみならず他のアセチル化部位での検討を行う必要が出てきたので同じくクロマチン免疫沈降法で解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
IL2-R/DRGFPカセット発現細胞をU2OS細胞で作成し、I-Sce1によるDNA二本鎖切断を行い、DNA修復が完了したことを示すGFP positive細胞をマグネットビーズを付与したIR2-Rの抗体でsortingした。結果は、sortingによりGFP-positiveな細胞を得ることには成功したが、先にも述べたように効率が予想より大きく下回り、細胞が増えるまで長期間を要したため当初の予定よりも少し研究の遅れが生じたが、解析系は、立ち上がりつつあり、成果が期待できると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNA損傷を与えてDNA修復が完了した細胞のかつて損傷があった部位でのヒストンの化学修飾を解析するシステムはおおむね立ち上がったので本年度は、損傷領域と損傷修復終了後のクロマチン構造の変化を比較する実験に移行して行きたい。本年度は最終年度でもあり、かつてDNA損傷があり修復が完了した部位におけるヒストンの化学修飾の変化とクロマチン構造の変化を時系列においても比較検討することを予定している。これらの結果を総合的に判断し、DNA損傷記憶の分子実体をクロマチンの視点から解明する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験系自体は、立ち上がりつつあるが、sortingした細胞がやや少ないので解析に想像していたより時間がかかり、また当初に予定していたより解析すべきヒストンの化学修飾が増え、繰り越しとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
解析すべきヒストン化学修飾が増えたのでその分の抗体購入あるいは作成、試薬の購入を行う予定である。
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