研究課題
放射線や他のDNA損傷因子はゲノムに損傷を誘発するが，ゲノム全体にわたる損傷の初期分布や部位ごとの修復効率の違いは明らかにされていない。本研究では，DNA-タンパク質クロスリンク（DPC）損傷に注目し，DPC形成部位と頻度をゲノム全体にわたり高分解能にマッピングし，クロマチン構造等との関連を解析する。本年度は，DPCを含むDNA断片を選択的に濃縮する手法を検討した。まず，DPCを含むモデルDNAを調製し，DPCをNHS-biotinで標識した。biotin標識したDNAをアビジンビーズでpull downし，変性処理によりDNAを回収した。しかし，良好なDNA回収率は得られなかった。そこで，制限酵素処理によるDNAの断片化，NHS-biotinのリンカーサイズ，アビジンビーズの種類を変え条件検討を行った。その結果，DNAの回収率を大きく向上することができた。次に，培養細胞をX線照射し，塩化セシウム密度勾配法によりDNAを精製した。DNAをNHS-biotinで標識後，制限酵素処理により適切なサイズに断片化した。モデルDNAで得られた条件を用いてDNAをpull downした結果，分析に十分な量のDNAが回収された。また，未照射細胞から精製したDNAはほとんどpull downされなかったことから，DNAがDPC依存的にpull downされていることが確認された。現在，回収したDNA断片のPCR増幅に対するクロスタンパク質の影響を検討するため，プロテアーゼ処理の影響を調べている。
2: おおむね順調に進展している
本年度は，DPCのbiotin標識とアビジンビーズを用いたpull downにより，DPCを含むDNAの選択的な濃縮法を確立することができた。また，次のステップであるDNA断片のPCR増幅条件検討にも着手した。
X線照射した培養細胞を試料として，DPCを含むDNAを選択的に濃縮し，次世代シーケンサーでDNA 断片を一括して配列決定する。得られた配列情報を用いて，DPC形成部位と頻度をゲノム全体にわたり高分解能にマッピングする。
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Journal of Radiation Research
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10.1093/jrr/rru122
