| 研究課題/領域番号 |
26550046
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
酒井 康行 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00235128)
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| 研究分担者 |
諏訪部 章 岩手医科大学, 医学部, 教授 (20241713)
岩沢 こころ 東京大学, 生産技術研究所, 研究員 (30402796) [辞退]
小笠原 理恵 岩手医科大学, 医学部, 助教 (70347871)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 細胞・組織 / 生物・生体工学 / 環境 / 薬学 |
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| 研究実績の概要 |
肺胞上皮細胞の培養条件については、前年度に確立したII型細胞の単離および播種条件を基礎として、様々な培養基質で被覆した半透膜培養器（カルチャーインサート）を用い、２週間までの形態や経上皮電気抵抗値を元に検討を行った。その結果、胎児型の基底膜成分を含むマトリゲルが最もよい結果を与えた。各種増殖因子のカクテルでの添加も行ったが、マトリゲル被覆では相乗的な効果は得られなかったため、以後、マトリゲル被覆したカルチャーインサートと通常の血清添加培養液を用いて実験を進めることとした。
In vivo肺胞では、ガス交換に与るI型上皮細胞は内腔面積の95%を覆い、II型細胞は隣り合った肺胞壁との連結部位、幾何学的に肺胞内腔の角となった部分に安定して存在している。もし、この特性を利用して、両者をバランスよく培養系で共存させることができれば、II型細胞が産生する各種肺サーファクタント層で薄く覆われた生理学的な肺胞内腔をin vitroで再構築することができるかもしれない。このための初期検討として、肺胞とほぼ同じ大きさ（326 マイクロメータ）を持ったシリコンゴムの一種であるPDMS（ポリジメティルシロキサン）マイクロウェル構造を持つシートを作成し上皮細胞を培養、I型・II型各々に特異的な表面マーカーにて免疫染色を行った。その結果、おおよその傾向として、中央底面部に扁平なI型細胞が、マイクロウェル近縁部と側面とで形成される角の部分にII型様の細胞が多く存在することを確認した。
一方、ラット肺胞由来初代培養マクロファージについては、毒性の低い1 マイクロmの二酸化チタン粒子を暴露し、その挙動を顕微鏡及びタイムラプスにより観察したところ，ヒト細胞株のTHP-1由来のものに比べ，貪食活性が極めて高く、仮足を広げ，遊走をしながら広範囲の粒子を積極的に貪食する様子が確認された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ラットは肺胞上皮I型細胞の膜上での安定的な培養条件については、確立を終えることができた。I型およびII型上皮細胞のin vivo様の共存状態実現については、まだ不十分ではあるが、肺胞とほぼ同じ大きさを持つマイクロウェル構造上に、薄い密度で単離されるII型細胞を播種培養することで、達成への見通しを得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
マイクロウェル構造を用いたI型およびII型の共存培養については、中央部の細胞もまだII型形質を残しており十分にI型に分化したとは必ずしも言えないものもあることから、播種条件や培養日数等の条件の最適化を引き続き行う。また、膜上に同様のマイクロウェル構造を作り、背面で血管内皮細胞との共培養も行う必要があるかもしれない。平行して、サーファクタントの産生等機能面での評価を進める必要もある。また、これらの条件設定で分化が不十分な場合には、マイクロウェル構造を持つ膜全体をエラスティックな材質で作成し、適度な伸縮運動を与える必要があるかもしれない。以上のように確立した培養条件を用いて、I型・II型共存上皮とマクロファージとの共培養を行い、蛍光標識されたナノ粒子を暴露、培養系内での粒子透過挙動を記述すると共に、その結果をラットin vivo暴露実験と比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分担研究者との打ち合わせの交通費を計上していたが、さらに最適な培養条件を決定するための実験を行う必要性が生じたため、打合せを延期し、電話会議のみとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
分担研究者との打合せはH28に行うこととした。また、実験用の動物（ラット）、試薬（エラスターゼなど）、マイクロウェル形状を持つ半透膜製作のための材料（ポリジメチルシロキサン）などの購入費用も予定している。
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