| 研究課題/領域番号 |
26550057
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
橋本 義輝 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (00323254)
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| 研究分担者 |
熊野 匠人 筑波大学, 生命環境系, 助教 (70585025)
小林 達彦 筑波大学, 生命環境系, 教授 (70221976)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 微生物 / 酵素 / 精製 |
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| 研究実績の概要 |
アジ化物は、極めて猛毒性の高い物質である。アジ化物は多方面で利用されている化合物ではあるが、その多くが毒性や爆発性を有する上に処理技術が不十分であるため、利用が敬遠される傾向にある。アジ化物が如何にして生合成・生分解されるかについての報告(微生物を含)は無く、その代謝(およびそれに関わる酵素および遺伝子)は未解明である。アジ化物分解経路が発見されれば、アジ化物の安全かつ簡便な分解処理に利用できる可能性とともに、アジ化物から有用な物質生産に広く利用できる可能性が期待できる。
本研究では、アジ化物分解酵素を分子レベルで解析し、得られる情報を基に、これらの物質を効率よく無害化する新たな微生物の育種を目的とする。
これまでに諸条件を検討し確立した最適培養条件でアジ化物分解菌を培養し、複数ステップのクロマトグラフィー操作によって、アジ化物分解酵素をSDS-PAGE上で単一バンドになるまで単離精製することに成功していたが、精製酵素は失活しやすく非常に不安定であり、精製酵素の収率が著しく低い問題点が残っていた。そこで、様々な条件検討を行うことで、本酵素の安定化方法の確立を目指したが、現在までに確立できておらず、本酵素を大量に調製することができていない。そのため、何度も大量培養を行い、大量に調製した菌体からアジ化物分解酵素の精製を行った。精製標品を用いて、基質特異性、至適pH、pH安定性など本酵素の諸性質を一部、解明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
精製途中および精製後のアジ化物分解酵素の安定性を向上させるために、様々な条件検討を行ったが本酵素の安定化条件が確立できなかった。しかし、大量培養と大量精製を繰り返すことで、本酵素の諸性質を調べるのに必要な酵素量を獲得した。精製標品を用いて、一部の諸性質を解明することに成功し、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
アジ化物分解酵素を精製し、その諸性質を解明したもののすべての諸性質を解明できていない。そのため、今後も引き続き大量培養および精製を行い、引き続き、本酵素の諸性質の解析を行う予定である。本酵素の大量調製を目的とし、引き続き本酵素の安定化条件の確立を目指す。
また、精製した酵素を用いてN末端部分アミノ酸配列および内部部分アミノ酸配列を決定し、その情報を基にオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、アジ化物分解菌の染色体DNAを鋳型として、サザンハイブリダイゼーション法により構造遺伝子全長をクローニングする予定である
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| 次年度使用額が生じた理由 |
アジ化物分解酵素の安定化条件を確立し、大量調製したアジ化物分解酵素の諸性質を解析する予定であった。しかし、アジ化物分解酵素の安定化条件を見いだせず、本酵素の諸性質の一部の解明に必要な酵素量しか獲得できていないため年度内の本酵素のその他の諸性質の解析や、N末端部分アミノ酸配列および内部アミノ酸配列の決定は不可能となり未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記の計画に必要な、分析用試薬、遺伝子操作試薬、HPLCカラム類、ガラス類、プラスチック類などの消耗品の購入や、情報収集のための旅費として使用する計画である。
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