生体内レニン活性の可視化解析技術の開発と病態解析及び治療法開発への応用

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26560229
• 研究機関: 川崎医科大学
• 研究代表者: 柏原 直樹 川崎医科大学, 医学部, 教授 (10233701)
• 研究分担者: 佐藤 稔 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (70449891)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: FRET / レニン活性 / in vivo imaging / 多光子レーザー顕微鏡 / 慢性腎臓病 / 糖尿病性腎症

研究実績の概要

蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：FRET）は2つの蛍光分子が近接した場合に、一方の蛍光分子（ドナー）から他方（アクセプター）へ励起エネルギーが電子共鳴によって直接移動する現象である。酵素活性を定量するために、FRET技術の応用が可能である。基質となるペプチド（FRETペプチド）のN端にドナー分子を結合させ、C端をアクセプター（クエンチャー）分子で標識する。2分子が近接状態ではドナー由来の蛍光はクエンチャーによって吸収されるため、蛍光を発しない。酵素によりFRETペプチドが切断されると、ドナーの由来の蛍光が検出可能となり、蛍光強度を測定することで酵素活性が定量評価可能となる。
レニン活性の検出には、レニンFRETペプチドとして、レニン基質ペプチドの両端に蛍光色素5-FAM及びクエンチャー分子QXL-520を結合したRenin FRET Substrate を用いた。多光子レ－ザ－顕微鏡を利用し、各種分子量の蛍光標識probeを用いラット、マウスの腎内微小血流、透過性変化を直接可視化するin vivo imaging法を確立している。この方法を基盤として、生体動物においてレニン活性を可視化する新規in vivo imaging技術を開発した。経静脈的にレニンFRETペプチドを投与し、多光子レーザー顕微鏡でレニン活性を検出しうることが明らかとなった。レニン阻害薬（Aliskiren）投与によりこの蛍光が強く抑制されることから、観察蛍光がレニン活性を示していることが支持された。食餌塩分摂取量を変化させ、血漿レニン活性を同時に測定し、蛍光強度との相関を解析し、両者が負の相関を示すことが明らかになった。
本技術を活用した各種病態腎における組織レニン活性変化の解析に現在取り組んでいる。

研究成果

• [雑誌論文] Deficiency of endothelial nitric oxide signaling pathway exacerbates peritoneal fibrosis in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kadoya H, Satoh M, Nagasu H, Sasaki T, Kashihara N.
  • 雑誌名: Clin Exp Nephrol. [Epub ahead of print] 巻: [Epub ahead of print] ページ: Epub ahead
  • 査読あり
• [学会発表] 組織レニン活性を可視化しうる新規技術の開発と糖尿病性腎症の病態解析及びCa拮抗薬の腎保護作用解明への応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 板野 精之、佐藤 稔, 角谷 裕之, 庵谷 千恵子, 桑原 篤憲, 藤本 壮八, 駒井 則夫, 佐々木 環, 柏原 直樹
  • 学会等名: 日本高血圧学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2014-10-17 – 2014-10-19
• [学会発表] 糖尿病性腎症におけるAzelnidipineの組織/血漿レニン活性に及ぼす影響の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 板野 精之, 佐藤 稔, 城所 研吾, 駒井 則夫, 佐々木 環, 柏原 直樹
  • 学会等名: 日本腎臓学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2014-07-04 – 2014-07-06
• [学会発表] 二光子レーザー顕微鏡による腎微小循環、濾過状態の可視化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 佐藤稔、柏原直樹
  • 学会等名: 日本腎臓学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2014-07-04 – 2014-07-06